裂殖壶菌脂肪酸合成相关蛋白过表达菌株的构建和酶法破壁提取油脂工艺的研究

摘要

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)属于n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)，能够促进神经系统的发育，对视觉和智力发育具有重要意义，此外还具有抑癌、抗炎、保护心脑血管等多方面的生物活性。裂殖壶菌（Aurantiochytriumlimacinum）是一种海洋真菌，其胞内油脂含量超过细胞干重的50％，DHA含量丰富，兼具安全质优、无毒易培养等优点，在健康保健和养殖饲料领域日益受到关注。本文主要从酶法破壁提取裂殖壶菌胞内油脂条件的优化、裂殖壶菌脂肪酸合成相关基因的克隆及构建超表达菌株等方面展开研究，为进一步提高裂殖壶菌的油脂含量及工业提取裂殖壶菌胞内油脂打下基础。
　　本文以裂殖壶菌Aurantiochytrium limacinum OUC168为研究对象，比较了酶法、超声和索氏提取三种方法的油脂和DHA提取效率;其中主要研究了不同酶在不同条件下的破壁效率，结果显示，破壁效率由高到低分别是木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞碱性蛋白酶＞纤维素酶＞葡聚糖酶和蜗牛酶＞溶菌酶。选取木瓜蛋白酶，中性蛋白酶和纤维素酶，并结合各破壁条件进行正交实验，确定了单酶的最优酶解条件为:木瓜蛋白酶，4000U/ml，pH6.5，45℃，4h，进一步将中性蛋白酶添加到酶切体系中组成复合酶，可以使酶解后的油脂提取率进一步提高，达56.37±1.41％，DHA提取率为12.82±0.66％;超声破碎法油脂提取率为58.2±3.91％，DHA提取率为12.02±2.09％;索氏提取法油脂提取率为61.42±1.90％，DHA提取率为12.06±0.74％。在油脂提取方面，索氏提取法破壁效率最高，其次为超声破碎法，最后为酶法;在DHA提取方面，酶法破壁效果最好，其次为索氏提取法，最后为超声破碎法。
　　酰基载体蛋白(ACP)是裂殖壶菌脂肪酸合成过程中的重要蛋白，本文克隆了裂殖壶菌的acp基因，分析发现acp基因有1个开放阅读框，编码由152个氨基酸组成的酰基载体蛋白(ACP)，通过预测，此蛋白分子质量约为16.44kDa，等电点5.63。ACP在PKS途径中是一种关键蛋白，主要作为脂肪酸合成过程中的酯酰基载体，蛋白的活性位点一般位于第37位的丝氨酸残基，其上具有磷酸泛酰巯基乙胺基结合位点。在脂肪酸合成过程中，酰基载体蛋白与辅基结合，作为载体将辅基结合到新生成的脂肪酸上，接着在酮酯酰-ACP合成酶、酮酯酰-ACP还原酶、烯酯酰-ACP脱水异构酶和烯酯酰-ACP还原酶等的催化作用下，合成多不饱和脂肪酸。
　　酮酯酰-酰基载体蛋白还原酶(KR)、脱水异构酶(DH)也是裂殖壶菌脂肪酸合成过程中的重要酶，由本实验室前期克隆获得，并构建了表达载体p18SZPC-KR-Cm、p18SZPC-DH-Cm。本研究构建了含有acp基因的表达载体p18SZPC-ACP-Cm，分别将上述3个载体转化入裂殖壶菌，通过筛选和检测，得到基因超表达菌株，生物性状分析结果显示，各转化菌株的生物量大于出发菌株，KR+转化株生物量为19.69±2.36 g/l;其次依次为ACP+转化株的19.02±2.27g/l;DH+转化株的18.73±0.83g/l;未转化菌株的生物量最低，为17.81±0.90 g/l。3种转化菌株的油脂含量和DHA积累量具有显著提高，尤其是KR+和ACP+转化菌株，KR+转化株油脂含量达到48.07±4.31％;其次依次为ACP+转化株的42.64±2.64％; DH+转化株的39.00±5.00％;未转化菌株的油脂含量最低，为36.24±3.76％。DHA结果显示，KR+转化菌株总DHA含量为8.47±2.26％，高于ACP+转化株的7.98±0.39％，高于DH+转化株的7.19±1.75％;而未转化菌株的总DHA含量为6.71±1.60％1; KR+，ACP+，DH+转化菌株的总DHA含量分别比未转化菌株高出26.23％，18.93％和7.15％。
　　本研究优化了酶法破壁的条件为工业提取裂殖壶菌胞内油脂和DHA提供了实验依据;通过克隆裂殖壶菌脂肪酸合成相关基因及构建超表达菌株，为从分子水平提高裂殖壶菌的DHA含量奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 综述

第一节 裂殖壶菌研究概况

1．1 裂殖壶菌的命名与分类

1．2 裂殖壶菌的营养成分

1．3 裂殖壶菌破壁方法

1．4 裂殖壶菌的遗传转化研究

1．5 裂殖壶菌的应用

第二节 DHA合成途径及酰基载体蛋白的功能研究

2．1 DHA的来源与合成

2．2 酰基载体蛋白的功能研究

2．3 裂殖壶菌中的脂肪酸合成

第三节 研究目的和意义

第二章 裂殖壶菌破壁方法的研究

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

1．2 方法

2 结果与讨论

2．1 不同酶破壁油脂提取率的比较

2．2 单因子实验结果

2．3 正交实验结果

2．4 复合酶破壁结果

2．5 超声破碎法、索氏提取法与酶法提取结果的比较

3 讨论

第三章 DHA合成相关蛋白过表达菌株的构建

1 实验材料

2 实验方法

2．1 acp基因的克隆

2．2 acp超表达载体的构建

2．3 表达载体的转化

2．4 阳性克隆菌株的筛选

2．5 阳性克隆菌株鉴定

2．6 转化菌株的性状分析

3 结果与分析

3．1 acp基因的克隆结果

3．2 acp超表达质粒构建结果

3．3 阳性克隆菌株筛选结果

3．4 裂殖壶菌阳性克隆的鉴定结果

3．5 转化菌株的性状分析

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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