鱼类淋巴囊肿病毒感染对27.8kDa受体表达及牙鲆鳃转录组表达的影响

摘要

淋巴囊肿病是危害水产养殖业健康发展的重要病毒性疾病之一，已知可感染超过42科140种以上的淡水、半咸水和海水鱼类。淋巴囊肿病毒(lymphocystisdisease virus，LCDV)为该病的病原，在我国养殖的牙鲆（Paralichthys olivaceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）和花鲈（Lateolabrax japonicus）等经济鱼类中流行较为广泛。研究表明LCDV是通过受体介导作用进入宿主细胞。本实验室前期曾在牙鲆鳃细胞系(FG)上鉴定出一个27.8kDa受体蛋白与LCDV感染有关，并制备了抗27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体。本文在牙鲆FG细胞和胚胎细胞(HINAE)上分析了LCDV感染与27.8kDa受体蛋白表达的相互关系;研究了该受体蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鲈中的组织分布及LCDV感染诱导的动态表达特点;探究了27.8kDa受体蛋白在LCDV感染牙鲆外周血白细胞的作用，研究结果促进了对LCDV侵染机制及传播途径的认识;通过RNA-seq分析了LCDV感染后牙鲆鳃转录组表达变化，为揭示LCDV致病机理提供重要数据。具体研究内容和结果如下:
　　(1)牙鲆FG和HINAE细胞上27.8kDa受体蛋白表达与LCDV感染的相互关系研究。蛋白免疫印迹表明，抗27.8kDa受体蛋白单抗可以特异性地结合FG和HINAE细胞膜蛋白中的一条分子量为27.8kDa的蛋白;病毒受体共荧光染色发现，27.8kDa受体表达于FG和HINAE细胞表面，并与LCDV共定位;病毒感染后，细胞中受体蛋白的表达通过双抗夹心ELISA进行检测，结果发现受体蛋白表达水平与病毒滴度呈正相关;感染9天期间，细胞中受体蛋白表达呈先上升后下降趋势;感染期间，细胞中LCDV载量通过荧光定量PCR进行检测，结果发现，病毒的增殖规律与受体蛋白类似，但是其峰值出现时间比受体蛋白要晚。感染过程各个取样时间点，FG细胞中27.8kDa受体蛋白和LCDV载量都比HINAE细胞高。单抗阻断实验显示，当增加抗27.8kDa受体蛋白单抗浓度，感染后细胞中27.8kDa受体蛋白的上调表达和LCDV增殖会受到明显抑制，体外感染实验中相应的细胞病变也明显减少。这些结果表明，预封闭抗27.8kDa受体蛋白单抗可以抑制感染后细胞受体的表达及病毒增殖。本项研究表明，LCDV感染后可以引发细胞中27.8kDa受体出现上调表达，从而又增加了细胞对于LCDV的易感性。
　　(2)27.8kDa受体蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鲈的组织分布及LCDV感染后的表达动态。以抗27.8kDa受体蛋白单抗为检测探针，利用间接免疫荧光和免疫组织化学技术对三种健康鱼的鳃、胃、肠、皮肤、脑、心脏、肝脏、脾脏、头肾、体肾和性腺进行检测，结果表明所检测的组织中都有27.8kDa受体蛋白的阳性信号;利用间接ELISA检测组织中27.8kDa受体蛋白的表达，该受体在健康牙鲆鳃和胃中表达最高，在体肾中表达最低;在大菱鲆中，该受体表达在胃、鳃、心脏和肠中表达相对较高，在卵巢和脑中表达相对较低;在花鲈中，受体表达在鳃和表皮中表达相对较高，在体肾和脑中表达相对较低。病毒感染后，组织中27.8kDa受体蛋白表达呈上调表达。实时荧光定量PCR结果表明，病毒拷贝数随着时间进程而逐渐增多，且较高的LCDV载量一般出现在感染前受体表达量较高的组织。用感染后的血细胞进行间接免疫荧光检测，结果表明，红细胞中没有27.8kDa受体蛋白和LCDV阳性信号，但是某些白细胞亚群中有两者的阳性信号。本研究表明，来源于牙鲆的27.8kDa受体蛋白也在大菱鲆和花鲈感染LCDV中扮演受体蛋白角色，外周血白细胞对病毒的易感性可能导致LCDV在体内的全身感染;LCDV在牙鲆、大菱鲆和花鲈中存在垂直传播的可能。这些数据有助于理解淋巴囊肿致病机理和在鱼类的传播途径。
　　(3)27.8kDa受体蛋白在LCDV感染牙鲆外周血白细胞的意义。本研究通过定位感染病毒后外周血27.8kDa受体蛋白及LCDV的分布来分析LCDV的血液传播。感染3小时后，在牙鲆红细胞中没有检测到27.8kDa受体蛋白和LCDV的阳性信号，但是在部分白细胞中出现了两者的阳性信号。免疫电镜证实，细胞膜表面确实由27.8kDa受体蛋白分布;流式细胞术表明，白细胞中27.8kDa受体蛋白阳性细胞率为14.28％。透射电镜下，对白细胞体外感染LCDV的超薄切片进行观察，结果发现，感染病毒1小时后，病毒吸附于白细胞膜上，而感染36小时后，细胞中LCDV复制则非常充分。多荧光染色实验表明:1）白细胞上27.8kDa受体蛋白和LCDV阳性信号出现共定位于部分白细胞表面;2）CD3阳性细胞与LCDV阳性细胞不交叉;(3)所有的IgM和IgD阳性细胞都对LCDV易感。本研究表明，27.8kDa受体表达于部分白细胞表面，导致这些细胞对LCDV易感，IgM+和IgD+白细胞很可能参与了LCDV的血液传播。
　　(4)牙鲆感染LCDV后鳃组织的转录组学研究。牙鲆感染LCDV一周后，采用RNA测序技术(RNA-seq)分析鳃中的差异表达基因。选取感染和未感染LCDV的鳃组织RNA，通过Illumina HiSeq2500测序平台进行混合测序。测序后共获得193，225，170个clean reads，拼接组装后得到106，293个unigenes，其中36，537个(34.37％)在公共数据库被成功注释。分析感染前后基因表达水平发现，感染后共有1812个基因出现上调表达，1626个基因发生下调表达，这些差异基因富集于14个Gene Ontology子集和22条信号通路。对这些差异基因进行功能分析发现，它们参与了炎症反应、泛素-蛋白酶体通路、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤形成及抗病毒感染。实时荧光定量PCR结果表明，RNA-seq结果准确可靠。本项研究数据不仅有助于鉴定与发现牙鲆新基因，并首次对于LCDV感染早期的转录组学应答进行了分析。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 牙鲆淋巴囊肿病毒的研究进展

1．1．1 鱼类淋巴囊肿病流行规律概述

1．1．2 LCD的病理学研究

1．1．3 鱼体对LCDV感染的免疫应答

1．1．4 LCDV分子结构

1．1．5 LCDV传播途径研究

1．1．6 LCDV的体外培养方法

1．1．7 LCD的诊断学研究

1．1．8 LCD的防治方法

1．2 动物病毒受体研究方法概述

1．2．1 病毒受体的生物学特性

1．2．2 病毒受体研究方法

1．2．3 水生动物病毒受体的研究进展

1．2．4 27．8kDa受体蛋白的研究进展

1．3 转录组学在动物病毒性疾病研究中的应用

1．3．1 转录组学介绍

1．3．2 转录组学研究常用技术介绍

1．3．3 转录组学技术在动物病毒性疾病研究中的应用

1．4 本论文的研究目的及意义

2．牙鲆FG和HINAE细胞上27．8kDa受体蛋白表达与LGDV感染的动态关系

2．1 牙鲆鳃细胞和胚胎细胞培养及LCDV提纯

2．1．1 实验材料与试剂

2．1．2 方法

2．1．3 结果

2．1．4 讨论

2．2 牙鲆27．8kDa受体蛋白与LCDV相互作用关系研究

2．2．1 材料与仪器

2．2．2 实验方法

2．2．3 结果

2．2．4 讨论

3．27．8kDa受体蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鲈的组织分布及LCDV感染后的表达动态研究

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验对象

3．1．2 试剂及仪器

3．2 方法

3．2．1 组织冰冻切片的制备

3．2．2 间接免疫荧光实验(IIFA)

3．2．3 石蜡切片的制备

3．2．4 免疫组织化学染色(IHC)

3．2．5 病毒感染及取样

3．2．6 间接ELISA

3．2．7 绝对荧光定量PCR

3．2．8 血细胞中受体和病毒的分布

3．3 结果

3．3．1 间接免疫荧光定位27．8kDa受体蛋白的分布

3．3．2 免疫组织化学染色定位27．8kDa受体蛋白的分布

3．3．3 组织中27．8kDa受体蛋白感染病毒后的表达动态

3．3．4 病毒感染后组织中LCDV粒子的变化动态

3．3．5 感染后血细胞中病毒与27．8kDa受体蛋白的检测

3．4 讨论

4．27．8kDa受体蛋白在LCDV感染牙鲆白细胞的意义

4．1 材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 试剂与仪器

4．2 方法

4．2．1 感染后牙鲆血细胞中LCDV与27．8kDa受体蛋白检测

4．2．2 免疫电镜

4．2．3 流式细胞术

4．2．4 LCDV体外感染牙鲆白细胞及电镜观察

4．2．5 多荧光免疫染色

4．3 结果

4．3．1 感染病毒后全血细胞中27．SkDa受体及LCDV分布

4．3．2 牙鲆外周血白细胞的采集

4．3．3 免疫电镜

4．3．4 流式细胞术

4．3．5 LCDV体外感染白细胞的时间进程

4．3．6 27．8kDa受体蛋白在LCDV感染白细胞中的作用

4．3．7 CD3、IgM和IgD阳性白细胞的LCDV易感性检测

4．4 讨论

5．牙鲆感染LCDV后鳃组织的转录组学研究

5．1 材料与仪器

5．1．1 实验动物与病毒

5．1．2 试剂与仪器

5．2 方法

5．2．1 牙鲆攻毒实验

5．2．2 RNA提取

5．2．3 RNA质量检测

5．2．4 文库构建、库检及上机测序

5．2．5 生物信息学分析流程

5．2．6 RNA-Seq数据的验证

5．3 结果

5．3．1 RNA质量检测

5．3．2 测序数据质量汇总

5．3．3 拼接转录本的长度分布

5．3．4 基因功能注释

5．3．5 CDS预测

5．3．6 基因表达水平及差异基因分析

5．3．7 差异表达基因的GO分类

5．3．8 差异表达基因的KEGG分析

5．3．9 病毒入侵及机体免疫应对感染的相关基因

5．3．10 RNA-seq结果的qPCR验证

5．4 讨论

5．4．1 LCDV 27．8kDa受体蛋白基因的差异表达

5．4．2 差异表达的细胞因子及相关基因

5．4．3 Toll样受体的应答变化

5．4．4 细胞凋亡相关基因的变化

5．4．5 获得性免疫相关基因

5．4．6 其他抗LCDV感染基因

总结

参考文献

致谢

个人简历

研究生期间的学术成果