牙鲆抗淋巴囊肿病转录组重测序及3个抗病基因的克隆与表达

摘要

牙鲆是一种具有经济价值的海洋鱼类，在亚洲许多国家的水产养殖业中都具有重要的地位。然而，日益增加的工业化养殖使牙鲆对多种病原菌（细菌、病毒和寄生虫）敏感，各种传染病的频发造成了严重的经济损失。这其中淋巴囊肿病的暴发，已成为限制牙鲆养殖发展的瓶颈。为了减少淋巴囊肿病的影响，通过研究相关的免疫系统来探索淋巴囊肿病毒的防御机制，对建立抗病品种或开发有效的疫苗和抗微生物药物都具有重要的意义。本文主要实验结果如下:
　　(1)对患淋巴囊肿病(S)和抗淋巴囊肿病(R)的牙鲆头肾进行了转录组重测序，所得到的原始数据经过质控后，我们在抗病组获得了平均序列条数为50712071条，包含5056521585bp的clean data;患病组获得了平均序列条数为53221069条，包含5307450541bp的clean data，碱基质量值超过20的在96.91％以上。并且所得到的clean data与牙鲆参考转录组mapping比率超过了82.73％。
　　(2)以p＜=0.05&FC＞=2作为筛选条件，将所有样本两两之间进行了比较，共得到了1024个差异表达基因，其中患病组相对抗病组表达上调的有430个，表达下调的有594个。在经过GO富集分析后，这些差异表达基因显著富集在与代谢相关的生物过程(BP)和与转运蛋白活性相关的分子功能(MF)中。经KEGG的pathway分析后，所有的差异表达基因注释到了260条pathway，其中有40条pathway显著差异(P≤0.05)，我们挑选出了12条与免疫相关的pathway，并从中筛选出了在多个payhway中起关键调控作用的几个表达差异显著的基因进行进一步分析。
　　(3)在本课题组前期，曾对牙鲆患淋巴囊肿病和抗淋巴囊肿病的个体头肾进行了转录组测序。在无参转录组条件下，通过序列拼接，组装和注释后，获得了3个在抗病组高表达的基因:thbs2、tbc1d25和efhd2。利用RACE-PCR技术，从牙鲆组织总RNA中克隆了3个基因的全长序列，结果显示:thbs2的基因全长3991bp，含长度为3558bp的ORF，编码1185个氨基酸。其中5'UTR的长度为443bp;tbc1d25的基因全长3254bp，含长度为2604bp的ORF，编码867个氨基酸。其中5'UTR的长度为265bp，3'UTR的的长度为385bp;efhd2的基因全长1588bp，含长度为702bp的ORF，编码233个氨基酸。其中5'UTR的长度为433bp，3'UTR的长度为453bp。氨基酸同源序列比对中，牙鲆的这3个基因，均与尖吻鲈的同源性较高。并且氨基酸同源比对和系统进化分析都表明牙鲆的thbs2、tbc1d25和efhd2这3个基因与各种脊椎动物保持较高的同源性（71％到95％）。
　　(4)利用qRT-PCR检测了，thbs2、tbc1d25和ethd2这三个基因在患淋巴囊肿病和抗淋巴囊肿病的牙鲆不同组织中的表达情况，结果显示:这3个基因在抗病组的血液中表达量均表现出上调，并且tbc1d25的表达差异显著，而thbs2在患病组的血液中几乎不表达;thbs2在大多数抗病组组织中，均表现出表达上调，并且在肝脏、鳃、心脏和肌肉中表达差异显著。

目录

声明

摘要

1引言

1．1淋巴囊肿病毒的研究现状

1．1．1淋巴囊肿病的流行病学

1．1．2淋巴囊肿病毒在细胞内的增殖

1．1．3淋巴囊肿病毒的传播途径

1．1．4淋巴囊肿病毒基因组学

1．1．5牙鲆抗淋巴囊肿病的免疫基因研究进展

1．2转录组学的研究

1．2．1转录组的测序技术

1．2．2转录组测序技术的优缺点

1．2．3基于转录组测序的牙鲆免疫相关基因的研究进展

2．1材料及方法

2．1．1主要仪器及试剂

2．1．2实验鱼的制备及样品处理

2．1．3 RNA的提取与鉴定

2．1．4 cDNA文库的构建及测序

2．1．5对测序结果进行生物信息学分析

2．2结果与分析

2．2．1测序的原始数据质控及mapping比率

2．2．2 RNA-seq整体质量评估

2．2．3基因差异表达分析和表达模式聚类

2．2．4差异基因注释及富集分析

2．3讨论

3．1．1主要仪器及试剂

3．1．2试验鱼的制备及样品处理

3．1．3 RNA的提取与鉴定

3．1．4总RNA的逆转录

3．1．5引物设计

3．1．6 RACE(Rapid Amplification cDNA Ends)实验

3．1．7牙鲆基因的序列分析

3．2结果与分析

3．2．1总RNA提取的质量检测

3．2．2基因克隆与序列分析

3．2．3系统进化树的构建

3．3讨论

4．1．1主要仪器及试剂

4．1．2实验鱼的制备及样品处理

4．1．3 RNA的提取与鉴定

4．1．4总RNA的逆转录

4．1．5引物设计

4．1．6荧光定量qRT-PCR

4．1．7定量数据分析

4．2结果与分析

4．2．1总RNA质量检测

4．2．2 qRT-PCR的结果

4．3讨论

4结论

参考文献

硕士期间发表论文

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致谢