钩藤不同组分干预高血压病肝阳上亢证模型大鼠的代谢机制研究

摘要

本研究来源于国家自然科学基金项目（NO：81473653）“多尺度法则指导下钩藤平肝潜阳效应物质基础与作用机制研究”。 目的：本文旨在研究钩藤平肝潜阳作用的效应物质，识别其中的核心成分和周围成分，实现核心成分体内作用机制的分子生物学精确描述和周围成分体内作用机制的代谢组学模糊描述，构建钩藤平肝潜阳“成分-靶标-通路”网络药理图。 方法：1.采用自发性高血压大鼠加灌附子汤的方法制备高血压病肝阳上亢证大鼠模型，采用钩藤不同成分敲出组分进行干预，观察干预过程中各组大鼠血压、易激惹程度、痛阈、旋转时间、24h饮水量以及面温等指标的变化，并在干预结束后对各组大鼠血清生化指标和代谢组学指标进行检测和分析。整合前期研究和本次研究的各项指标数据，采用SIMCA-P11.5软件进行偏最小二乘回归分析，根据回归分析的相关系数和变量重要性参数识别效应物质组的核心成分和周围成分。 2.采用钩藤平肝潜阳效应物质组的核心成分和周围成分干预高血压病肝阳上亢证大鼠模型，监测干预过程中各组大鼠血压指标以及“症状和体征”指标的变化。干预结束后，对于正常组、病证组、核心成分组：采用ELISA法检测各组大鼠血清生化指标，HE染色观察各组大鼠心、脑、肾组织病理学变化，扫描电镜观察各组大鼠肾动脉和肠系膜动脉内膜形态，Western Blot检测各组大鼠胸主动脉AKT和TGF-β1蛋白的表达，RT-PCR检测各组大鼠胸主动脉KK、ACE2和mas-1基因的表达；对于正常组、病证组和周围成分组，采用基于UPLC-Q-Exactive/MS的代谢组学技术检测各组大鼠血清代谢物信息，探索钩藤平肝潜阳周围成分的系统生物学代谢模式和干预标志物。经过以上实验，最终实现钩藤平肝潜阳效应物质组核心成分体内作用机制的分子生物学精确描述和周围成分体内作用机制的代谢组学模糊描述。 3.应用网络药理学手段，对钩藤平肝潜阳核心成分与周围成分的效应机制进行全面探究，构建平肝潜阳“成分-靶标-通路”网络药理图。 结果：1.钩藤敲出熊果酸组分和敲出齐墩果酸组分均能有效降低高血压病肝阳上亢证大鼠血压水平，降低大鼠面温，减少饮水量，能够提高大鼠痛阈、延长旋转时间，同时逆转高血压病肝阳上亢证大鼠血清生化指标的变化以及11个生物标志物的异常表达。结合前期研究结果进行综合药效分析发现，敲出熊果酸组、敲出异去氢钩藤碱组和缬沙坦组对高血压病肝阳上亢证大鼠的干预效果最好，其次为敲出去氢钩藤碱组，而敲出齐墩果酸组、敲出钩藤碱组和敲出异钩藤碱组效果较差，尤以敲出异钩藤碱组效果最差。 2.异钩藤碱能够有效降低高血压病肝阳上亢证大鼠血压水平，改善大鼠的“症状与体征”量化指标，逆转大鼠血清生化指标的异常变化，改善大鼠心、脑、肾组织光镜下的病理学变化，改善肾动脉和肠系膜动脉内膜形态，调整大鼠胸主动脉AKT、TGF-β1蛋白以及KK、ACE2和mas-1mRNA的异常表达。钩藤平肝潜阳周围成分能够有效降低高血压病肝阳上亢证大鼠血压水平，改善大鼠的“症状与体征”量化指标，对大鼠血清中参与脂类代谢以及能量代谢的13个差异代谢物的异常表达产生不同程度的调节。 3.网络分析发现钩藤平肝潜阳效应成分主要通过调控AKT2、CASP、IL4、IL10、MAPK1等50个靶点，干预MAPK信号通路、T细胞受体信号通路、Ras信号通路以及神经营养因子信号通路等8条主要通路，调节细胞因子、神经递质、激素等的表达从而发挥平肝潜阳的效应。 结论：1.异钩藤碱为钩藤平肝潜阳效应的核心成分。 2.异钩藤碱对高血压病肝阳上亢证大鼠产生干预效应的机制可能是通过调节血管内皮舒缩因子包括Ang II、ET-1和NO的水平，抑制RAAS系统和交感神经系统活性以及促进ACE-Ang1-7-mas-AKT信号通路中相关信号分子的表达，增强KK基因的表达，调节血管内皮舒缩因子的释放等途径实现的。异钩藤碱能够有效改善高血压病肝阳上亢证大鼠心、脑、肾组织病理形态学变化，改善大鼠肾动脉和肠系膜动脉内膜形态结构，抑制TGFβ-1蛋白的表达，从而改善大鼠血管的重构。钩藤平肝潜阳效应周围成分对高血压病肝阳上亢证大鼠干预效应的代谢组学机制可能是通过调节大鼠血清脂类代谢和能量代谢通路中13个相关的差异代谢物的异常表达来完成的。 3.钩藤平肝潜阳效应成分主要通过干预MAPK信号通路、T细胞受体信号通路、Ras信号通路以及神经营养因子信号通路等8条主要信号通路发挥平肝潜阳的效应。