基于和络泄浊,培土宁风法探讨和肾络宁风颗粒对慢性肾衰竭钙磷代谢紊乱的干预机制

摘要

目的：提出慢性肾衰竭钙磷代谢紊乱“肾络瘀滞，脾虚风动”的中医病机理论假说，探讨以“和络泄浊，培土宁风”法为治则的和肾络宁风颗粒对慢性肾衰竭钙磷代谢紊乱模型大鼠的干预机制及效验机理。 方法：采用5/6肾切除及高磷饮食制备慢性肾衰钙磷代谢紊乱大鼠模型。65只SPF级雄性Wistar大鼠按抽签法随机分为正常组（n=8只)、假手术组（n=8只)和模型组（n=49只）。将造模4周后存活大鼠60只随机分为如下7组进行药物干预：A.正常组（n=8）；B.假手术组（n=8）；C.模型组（n=10）；D.骨化三醇西药组（n=8）；E.中药低剂量组（n=8）；F.中药中剂量组（n=9）；G.中药高剂量组（n=9），持续给药8周。动态观察大鼠一般情况，记录精神状态、摄食、活动度、毛色、尿量、粪质与体重的动态变化。HE和PAS染色观察肾组织形态学改变。检测各组血清肌酐（Creatinine,Scr）、尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、24h尿蛋白定量、血钙（Ca2+）、血磷（P3+）、血清甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）血清碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）等。酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清Ⅰ型前胶原N端前肽（N-terminal propeptide of type1precollagen，PINP）水平。取各组大鼠肾组织通过光镜观察其病理组织学变化。免疫组化法分别检测大鼠肾脏Klotho蛋白、骨形态发生蛋白-7（Bone Morphogenetic Protein－7，BMP-7）、Wnt4、β-catenin及骨钙素（Osteocalcin，OC）、PINP蛋白表达水平；实时定量PCR检测大鼠肾脏Klotho、BMP-7、Wnt4、β-catenin基因表达情况；Western blot检测大鼠肾脏Klotho蛋白、BMP-7及骨组织成纤维细胞生长因子23（Fibroblast Growth Factor-23,FGF23）、OC的蛋白表达水平。 结果：1.模型组大鼠肾小球结构紊乱、系膜细胞增生，基质增多，部分肾小球硬化，肾小管代偿性扩张或灶状萎缩，肾间质内有大量炎性细胞浸润及局灶性纤维组织增生，而和肾络宁风颗粒中药中、高剂量组肾小球增生硬化程度及肾间质内炎性细胞浸润情况较模型组有改善。2.与模型组相比，和肾络宁风颗粒中高剂量组血Scr、BUN等水平明显降低，血Ca2+水平明显上升，体重增加，血PTH、ALP及PINP水平均有下降（P＜0.01）；与西药组比较，和肾络宁风颗粒中高剂量组在降低血Scr、BUN和P3+水平有统计学差异（P＜0.05），在提高血Ca2+、降低血PTH、ALP及PINP水平方面二者具有同等疗效（P＞0.05）。3.和肾络宁风颗粒中剂量组Wnt、β-catenin蛋白表达明显下降，基因表达下调，较模型组有差异（P＜0.01），与西药组亦有统计学意义（P＜0.05）。4.和肾络宁风颗粒中高剂量组Klotho蛋白及BMP-7基因表达上调，蛋白表达增加，FGF23蛋白和OC和PINP蛋白表达均明显降低，与模型组比较有统计意义（P＜0.05）；与西药组对比，和肾络宁风颗粒在降低FGF23蛋白表达方面差异显著（P＜0.01），上调BMP-7蛋白与基因表达（P＜0.05），在调控Klotho蛋白及基因表达的上调和对OC、PINP蛋白表达的抑制作用方面两者疗效相当（P＞0.05）。 结论：和肾络宁风颗粒能够减轻慢性肾衰竭钙磷代谢紊乱大鼠肾小球硬化等病理损害，改善体质状况；能够有效降低血肌酐、尿素氮，提升血钙水平，控制血磷、PTH及ALP，提高肾功能、改善矿物质代谢紊乱，且与中药浓度剂量呈一定正相关性。和肾络宁风颗粒能够抑制FGF23高表达，上调Klotho蛋白及基因表达，以调控Klotho/FGF23轴的动态平衡。并通过降低血P3+、PTH及SHPT水平，及协同促进BMP-7蛋白及基因表达等多种途径影响Wnt/β-catenin信号转导通路的活性，下调β-catenin，有效阻断β-catenin的靶基因转录，影响Wnt/β-catenin信号转导通路的激活。以进一步控制ALP的活性，降低OC、PINP异常表达和血清PINP浓度，从而抑制成骨细胞的异常分化和骨重建，调节骨代谢，发挥生物学效应。和肾络宁风颗粒发挥以调控Klotho/FGF23轴为主的综合作用改善慢性肾衰竭钙磷代谢紊乱及继发骨性营养不良，在一定程度上延缓病情进展。

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