碱蓬GST基因cDNA的克隆与表达及碱蓬cDNA过量表达文库转化拟南芥的研究

摘要

盐胁迫包括细胞的渗透胁迫和离子胁迫,以及由这两种胁迫而产生的次级胁迫即活性氧胁迫.细胞中积累的大量活性氧能够导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤.植物体内的抗氧化系统可以分为酶促反应系统和非酶促反应系统,其中酶促反应系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPOX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等.GSTs不仅能催化降解有毒的内源或异源代谢产物,降低这些物质导致的氧化损伤;而且同时具有GPOX活性,能够直接清除细胞内的活性氧.我们建立了一个过量表达碱蓬cDNA文库的系统,用以进行拟南芥的大规模转化.过量表达载体由pCAMBIA1200和pRT105组装而成,使得cDNA文库在CaMV35S启动子作用下过量表达.用cDNA插入子两侧的载体引物进行PCR扩增,结果表明cDNA文库中至少94﹪的克隆含有cDNA插入子.将过量表达文库的混合质粒经农杆菌介导用花序浸泡法进行拟南芥的遗传转化,在筛选的100,000粒种子中获得500株潮霉素抗性苗,8株表现出特异表征.在T<,1>代中,仅有20﹪的转基因植株为单拷贝插入.转基因植株的PCR鉴定呈现阳性,其耐盐性分析正在进行之中.

目录

文摘

英文文摘

第一部分综述

一、活性氧与盐胁迫

1活性氧的产生机制

2活性氧造成的氧化损伤

3谷胱甘肽转移酶(GST)

4酶促反应系统的其它酶类

二、突变体功能研究

1功能缺失突变(loss-of-function)

2功能获得突变(gain-of-function)

第二部分实验论文

第一章盐地碱蓬GST基因cDNA的克降与表达分析

一、材料和方法

1实验材料

2实验方法

二、实验结果与分析

1 GST基因的cDNA全长序列

2植物表达框架的构建

3盐地碱蓬GST基因拷贝数的检测

4盐地碱蓬GST基因的诱导表达

三、讨论

四、结论

第二章碱蓬cDNA过量表达文库转化拟南芥的研究

一、材料和方法

1实验材料

2实验方法

二、实验结果与分析

1 cDNA表达文库的检测

2农杆菌的电击转化检测

3拟南芥的遗传转化

4转基因植株的分析

三、讨论

1转基因植株的鉴定

2转基因植株的耐盐性分析

3碱蓬cDNA过量表达文库的意义

附图

附页

参考文献

致谢