小鼠精原干细胞的富集、移植与培养及GDNF在精子发生中的作用机制

摘要

本文应用了DBA/2、ICR、KM(昆明白)三个品系的野生型小鼠和一个细胞普遍表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的ICR转基因小鼠。睾丸取自出生后4至5天(出生日定为0天)的雄性乳鼠，并通过两步消化酶消化法收集睾丸细胞。消化液I是含0.2％胶原酶Ⅳ或者Ⅴ和200μg/mlDNA酶的D-PBS，消化液Ⅱ是含0.2％胶原酶Ⅳ或者Ⅴ、0.2％透明质酸酶和200μg/mlDNA酶的无血清DMEM。去掉睾丸白膜后的睾丸组织样品经PBS洗涤3遍后，用10倍体积的消化液Ⅰ在室温下作用3至5分钟。在此期间，用吸管轻轻吹打。然后加入5至10毫升PBS，170g离心3分钟，反复3次以去除睾丸间质细胞，收集曲细精管样品。后者用5倍体积的消化液Ⅱ消化2至5分钟，伴随着吸管反复吹打。 睾丸中的支持细胞和间质细胞等体细胞对精原干细胞的增殖有负作用。为了尽快去除体细胞，我们采用含10％血清、2mM谷氨酰胺、100unit/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基对睾丸细胞进行差异贴壁分选。我们发现用此培养基培养睾丸细胞时，支持细胞贴壁快，而生精细胞只是贴附在支持细胞层上，并且易于吹打悬起，可通过轻轻吹打后，将漂浮的细胞转移至新的明胶包被的培养瓶中贴壁培养。我们连续贴壁分选3次，时间分别为接种后的1、4、20小时。第3次贴壁后是否转瓶培养要根据支持细胞的去除程度和生长状况而定。 为验证差异贴壁分选的效率，我们对第3次贴壁培养过夜的分选出的细胞进行了流式分析，以新分离的未分选睾丸细胞的流式分析结果作为对照。检测抗原是Thy-1、EP-CAM和GFRα1等，这些抗原已被证明是精原干细胞标志抗原。流式分析结果表明，经过连续三次贴壁分选后，精原干细胞分别被富集了20.3、11、14.8倍。与以前报道的利用这三种抗原进行的免疫激活细胞分选和荧光激活细胞分选的效率相比，我们的差异贴壁分选的效率是较高的。由于睾丸中的精原干细胞不仅数量少，而且至今还没有鉴定出特异性的标志抗原，这一分选效率可以起始精原干细胞的培养。 为确定分选出的睾丸细胞中含有精原干细胞并维持干细胞活性，我们进行了移植分析实验。白硝安(40mg/kg体重)处理的8至10周龄的ICR雄性小鼠作为受体，供体细胞来自转EGFP的ICR乳鼠。吸管吹打第三次贴壁后的培养物，转移漂浮细胞至15ml离心管，250g离心收集细胞。经0.25％胰酶消化成单细胞后，调整细胞密度为(0.5-100)×103细胞/μl。腹腔注射640mg/kg体重的阿佛丁麻醉小鼠后，一侧睾丸经睾丸网注入15μl上述细胞悬液，留对侧睾丸作为对照。移植2个月后，收集睾丸在紫外光下观察，发现供体精原干细胞在受体的曲细精管中产生了生精克隆。为进一步验证移植的精原干细胞在受体睾中能产生精子和具有受精能力，我们将移植过分选细胞的5只ICR雄鼠分别与5只野生型ICR雌鼠合笼，结果在移植后113天时有两窝生产了共17只乳鼠，其中有3只是杂合的转EGFP小鼠。这说明含10％血清的培养基分选出的睾丸细胞中不仅含有精原干细胞，而且干细胞保持其正常生精活性。 以前的报道表明，血清导致精原干细胞分化。经过反复多次的尝试，我们设计和确定了良好的精原干细胞无血清培养基。培养基成份是StemPro-34SFM和StemPro营养补充剂，添加25μg/ml胰岛素，100μg/ml转铁蛋白，60μM腐胺，30nM亚硒酸钠，6mg/mlD-(+)-葡萄糠，50μmβ-巯基乙醇，100nM维生素C，10μg/mld-生物素，30μg/ml丙酮酸钠，1μl/mlDL-乳酸，5mg/ml牛血清白蛋白，2mML-谷氨酰胺，MEM维生素溶液，MEM非必需氨基酸溶液，10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子，20ng/ml重级大鼠GDNF，200ng/ml重组大鼠GDNFsRα1(GFRα1)等。贴壁分选出的细胞可直接或经再次贴壁后转至10μg/ml丝裂酶素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，换成上述无血清培养基，置于37℃、5％CO2条件下培养。 一般情况下，培养3至4天可观察到精原干细胞克隆的产生。克隆大小通常在4至80个细胞，细胞成串或呈不规则的细胞团，细胞之间有明显的胞质桥相连。为了进一步除去睾丸体细胞，分选出的细胞在转到MEF饲养层培养后，最初的2至3次传代，仍是用吸管吹打后将漂浮的细胞转到新的MEF饲养层上。我们已经成功地从DBA/2、ICR、KM三个品系的小鼠睾丸中分离、分选出富集的精原干细胞，40多次培养实验的培养时间都在20天以上，最长为28天，在MEF饲养层上传代5次。其中，从KM小鼠中分离和培养精原干细胞是世界上该研究领域中的首例。我们的研究还表明，DBA/2和KM两个品系小鼠的精原干细胞比ICR品系的易于培养。 为了证明我们培养的细胞是精原干细胞，我们首先通过免疫细胞化学染色方法对已知的精原干细胞标志抗原进行了检测。检测抗原是Oct4、GFRα1、c-Ret和NCAM。免疫荧光染色的结果表明，培养的细胞克隆表达这些精原干细胞标志抗原。这一结果连同培养的细胞克隆的形态特征说明我们培养的细胞属于精原干细胞。 为进一步确认我们的假设，我们又通过RT-PCR方法对已知的精原干细胞标志基因进行了检测。检测基因是oct4、sox2、nanog、GFRα1、ngn3、c-Ret、Zfp145、piwil2、c-kit、Dazl、、pum1和pum2等。检测结果表明，培养细胞表达Dazl(生殖细胞特异性标志基因)、puml、pum2(两个减数分裂前的生殖细胞标志基因)和较弱的c-kit(分化的A型精原细胞标志基因)。同时高水平表达piwil2、GFRα1、c-Ret和Zfp145，而ngn3(未分化A型精原细胞标志基因)的表达水平较弱。Piwil2可能在精原干细胞的自我复制过程中起一定作用；GFRα1和c-Ret分别是GDNF的辅助受体和膜受体；Zfp145编码的PLZF是一种锌指蛋白转录抑制因子，可能是GDNF信号通路通路的最终效应因子之一。这些标志基因的高水平表达又一次标明，我们培养的细胞克隆是真正的精原干细胞。因此，我们首次建立了长期的来自于KM小鼠的精原干细胞培养物。重要的是，我们同时检测到oct4和sox2在培养细胞上的表达，说明Oct4/sox2调控复合物可能在精原干细胞的自我复制中起作用，这是精原干细胞研究中的首次报道。 我们的研究还表明，GDNF是维持精原干细胞自我复制的主要因子，可溶性的GFRα1和bFGF也是不可缺少的因子。这说明GDNF信号通路和FGF通路是精原干细胞自我复制的两条主要维持通路。与此相反，由于培养基中LIF的有无并不影响精原干细胞克隆在体外的形成与增殖，因此LIF/gp130信号通路可能在维持精原干细胞的自我复制中不起作用。 总之，上述的研究已经建立起了一个体系，包括通过差异贴壁分选来富集生殖细胞的方法、无血清培养基、MEF饲养层、精原干细胞移植分析和多个精原干细胞标志基因的鉴定。这一体系可以作为分离、富集租培养其它哺乳动物的精原干细胞的范例。但精原干细胞自我复制机制的阐明和精原干细胞体外长期培养条件的优化还需要进一步研究。精原干细胞不仅是制作转基因动物的重要资源，它的体外诱导分化也是阐明精子发生机理的重要途径，尤其人精原干细胞的体外培养将具有重要的临床意义。 另外，我们还进行了GDNF对支持细胞增殖的影响及其作用机制的研究。在此之前，这方面的研究报道很少，并且GDNF在支持细胞中的确切作用以及信号通路机制也没有阐明。因此，我们用高度纯化的、体外原代培养的分离于4-5天乳鼠睾丸的支持细胞作为研究材料，研究GDNF在支持细胞中的表达与调控、GDNF在支持细胞增殖中的作用以及可能的信号通路机制。 我们分别通过半定量RT-PCR和免疫细胞化学方法对GDNF在支持细胞中的表达与调控在mRNA和蛋白质两个水平上进行了研究。培养的支持细胞经过FSH、睾酮和雌二醇的不同剂量或不同时间的处理后，分别进行RT-PCR和免疫细胞化学分析。结果表明，FSH上调GDNF表达，而睾酮和雌二醇对GDNF的表达没有影响。因此，我们认为在支持细胞中，GDNF的表达是受FSH调控的。 为确定GDNF对支持细胞的作用，我们首先用MTT活体染色法测定培养的支持细胞的活力。结果显示，10ng/ml和20ng/mlGDNF都显著提高了570nm吸光率，而且10ng/mlGDNF加上50ng/mlFSH的处理使570nm吸光率提高到了更高的水平。BrdU掺入法标记增殖期的支持细胞数量的计数结果说明，GDNF单独处理时，或与FSH共同处理时，都显著提高了增殖期支持细胞的数量。说明GDNF促进支持细胞在体外的存活和增殖，并与FSH有协同效应。 为了阐明GDNF促进支持细胞增殖的作用机制，我们通过RT-PCR和免疫细胞化学方法研究支持细胞表达哪些GDNF受体。结果表明，未成熟小鼠支持细胞表达GFRα1和NCAM，但不表达Ret，说明GDNF可能是通过不依赖Ret的途径发挥作用的。为了证实我们的假设，我们进行了免疫抑制实验。当在含GDNF的无血清培养基中加入抗NCAM抗体后，显著降低了增殖期的支持细胞的百分比，说明GDNF/GFRα1/NCAM通路是支持细胞中起作用的通路。 因此，我们得出结论，GDNF在支持细胞中的表达是受FSH调控的，GDNF作为自分泌因子能促进未成熟支持细胞的增殖，这种促增殖作用是通过GDNG/GFRα1/NCAM途径进行的。

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