鲤鱼肠道中乳酸菌粘附相关蛋白质的鉴定研究

摘要

粘附(adhesion)是指细菌与粘液(mucus)或上皮细胞通过生物化学作用产生的特异性粘连,是细菌定植的第一步.肠道中各种粘附相关成分是介导细菌粘附的基础,对这些成分的研究分析是阐明益生菌对肠道粘附机理的必要条件,而粘附机理的深入研究对于消化道微生态环境的改善以及病原菌的生态防治均具有重要意义.益生乳酸菌在肠道中的定植能够排斥外来病原菌的入侵,从而起到生物拮抗的作用. 本文以从健康牙鲆肠道分离筛选的乳杆菌新种L15(Lactobacillus L15)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus ATCC4356)为实验菌株,对鲤鱼肠粘液中参与乳酸菌粘附的受体蛋白进行鉴定和分析,并对该粘附受体在肠道上皮细胞表面的分布进行了研究. 用酯化生物素标记的L15和嗜酸乳杆菌表面蛋白进行蛋白印迹实验,结果显示,在鲤鱼肠道前段及中段的粘液中有相同的粘附相关受体,分子量约为26.2kDa;在鲤鱼肠道的后段,粘液成分与前段和中段的差异较大,而且没有粘附相关条带.用该受体蛋白免疫小鼠,免疫印迹检测抗血清的特异性,结果表明在1∶200稀释度可特异性地与粘液中的受体蛋白结合.免疫印迹的结果进一步证实,在鲤鱼肠粘液的前段和中段均有26.2kDa的受体蛋白存在,虽然L15和ATCC4356的表面蛋白成分不同,但它们在鲤鱼肠粘液中均有相同的受体成分,而在后段的肠粘液中无此受体蛋白. 应用体外粘附模型,研究了粘附受体蛋白在2种乳酸菌和致病性大肠杆菌对鲤鱼肠粘液粘附中的作用.3种菌对鲤鱼肠粘液均呈现不同程度的特异性粘附,而受体蛋白的抗血清对这3种菌的粘附均有明显的抑制作用,说明该26.2KD的蛋白与L15和嗜酸乳杆菌的粘附相关,为这2种菌在鲤鱼肠粘液中的粘附受体,而且也是大肠杆菌在鲤鱼肠道内定植的粘附受体蛋白.乳酸菌与大肠杆菌对鲤鱼肠粘液均有一定的粘附作用,因此在宿主肠道内可竞争同一受体,从而使乳酸菌达到拮抗病原菌定植的作用,抵御病害的侵袭.通过对鲤鱼肠道石蜡切片进行HE染色和AB-PAS染色,显示了鲤鱼肠道的组织结构特点和糖蛋白的分布,进一步从组织细胞水平观察了鲤鱼肠道,了解了其的肠道结构,提示了可能存在的粘附受体分布;利用抗血清对鲤鱼肠道组织切片进行免疫组化实验,结果显示,乳酸菌的粘附受体由肠道上皮粘液细胞分泌,主要分布于鲤鱼肠道的前段和中段.

目录

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综述 鱼类乳酸菌的粘附研究进展

1乳酸菌在水产养殖业中的应用

2乳酸菌在动物肠道中的粘附

3乳酸菌表面粘附素成分研究进展

4肠道中粘附相关受体的研究

第一部分鲤鱼肠道中粘附相关蛋白的鉴定

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、分析与讨论

第二部分粘附相关蛋白的抗血清制备

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、分析与讨论

第三部分乳酸菌体外粘附和粘附抑制实验

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、分析与讨论

第四部分鲤鱼肠道的组化及免疫组化实验

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、分析与讨论

结论

参考文献

致谢

附录