鲤鱼抗菌肽hepcidin的基因克隆、表达及其功能的研究

摘要

抗菌肽是一类具有抗菌活性的内源性小分子多肽，广泛存在于生物界，具有广谱杀菌作用，且不会产生耐受性，是机体非特异性免疫的重要组成部分。Hepcidin是一类富含半胱氨酸的抗菌肽，在肝脏中的表达量较高，又称之为肝脏表达的抗菌多肽，在体内或体外具有抑制细菌、真菌及原生动物生长的作用，并且具有调节机体铁代谢的功能。
　　本文根据斑马鱼 hepcidin cDNA序列设计引物，克隆得到鲤鱼 hepcidin的cDNA片段，然后采用RACE技术得到其全长 cDNA，并对其编码的多肽结构和系统进化进行了分析；采用PCR方法扩增得到了鲤鱼 hepcidin的基因组DNA序列，并对其内含子-外显子结构进行了分析；采用RT-PCR方法检测了hepcidin mRNA在正常鲤鱼肝脏、脾脏、头肾、前肠、后肠、口腔上皮、鳃、皮肤、肌肉、性腺和血液等组织的分布，采用Real-time PCR技术检测了鳗弧菌浸泡刺激后鲤鱼肝脏、头肾、前肠和后肠中hepcidin mRNA水平的变化；构建了原核表达载体 pET32a(+)/hepcidin，并转入大肠杆菌 AD494(DE3)中诱导表达，表达的融合蛋白经肠激酶酶切后，采用抑菌圈法检测其对大肠杆菌的抑菌活性。
　　鲤鱼hepcidin cDNA全长647 bp，由46 bp的5'非翻译区(5'-UTR)，276 bp的开放阅读框(ORF)和325 bp的3'非翻译区(3'-UTR)组成，其中ORF区编码91个氨基酸的前体hepcidin，由24个氨基酸残基的信号肽、42个氨基酸残基的前域和25个氨基酸残基的成熟肽组成。鲤鱼hepcidin成熟肽由25个氨基酸组成，含有8个保守的半胱氨酸残基，通过4个链内二硫键形成短的发卡结构，拐角处有一特殊的二硫键，可能与多肽的抗菌活性直接相关。
　　鲤鱼 hepcidin基因组DNA全长1209 bp，由三个外显子和两个内含子组成，外显子1编码部分5'-UTR、信号肽和部分前域，外显子2编码部分前域，外显子3编码部分前域、成熟肽和3'-UTR。
　　序列比对和系统进化表明，鱼类 hepcidin序列之间的相似性较高，而鱼类与哺乳动物和两栖动物处于不同的分支上，在鱼类中，鲤鱼与斑马鱼、鲶鱼处于同一分支，其中，鲤鱼与斑马鱼的亲缘关系最近。
　　RT-PCR检测表明，在正常鲤鱼中，肝脏中hepcidin mRNA水平最高，其次为脾脏、后肠、头肾、前肠、口腔上皮、皮肤、性腺和血细胞，在鳃中的水平较低，而在肌肉中则未检测到其 mRNA。
　　Real-time PCR检测表明，鲤鱼经过鳗弧菌浸泡刺激后，各组织 hepcidin mRNA水平整体呈现先升高后下降的趋势，但不同组织的变化模式并不相同。肝脏、头肾和后肠hepcidin mRNA水平在刺激后6 h就达到最大值，肝脏中约为正常水平的3倍，头肾和后肠可达到正常水平的17倍；前肠 hepcidin mRNA水平在刺激后6 h开始升高，到72 h才达到最大值，约为正常水平的8倍。
　　鲤鱼 hepcidin成熟肽 cDNA长75 bp，本实验在其两端设计带酶切位点的引物，PCR扩增片段双酶切后与 pET-32a(+)质粒连接，构建 pET-32a(+)/hepcidin原核表达载体，重组质粒经双酶切和测序鉴定正确后，用于后续的诱导表达。
　　pET-32a(+)/hepcidin重组质粒转化大肠杆菌 AD494(DE3)，经 IPTG诱导融合蛋白的表达，超声裂解细菌，SDS-PAGE检测，细菌裂解上清和包涵体沉淀中在分子量为20 kD处均有一特异性条带，与 hepcidin融合蛋白的预期分子量(20.2kD)基本一致。以可溶性形式表达的融合蛋白在诱导后2 h开始出现，以后表达量逐渐升高，到第6 h时达到最大比例，稳定至10 h后又逐渐下降；以包涵体形式表达的融合蛋白也是在诱导后2 h开始出现，以后有所升高，但没有明显的规律，且相应诱导时间的表达量低于可溶性形式表达的融合蛋白。因此，在后续的融合蛋白的大量诱导实验中，采用诱导6 h的可溶性形式的融合蛋白，结果表明，融合蛋白的浓度明显高于小量诱导的蛋白，可以用于下一步的实验。
　　大量诱导表达的hepcidin融合蛋白经肠激酶酶切后，采用抑菌圈法检测表明，其对大肠杆菌具有一定的抑菌活性。因此，原核表达的hepcidin可以用于hepcidin功能的进一步研究。

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中文摘要

英文摘要

综 述

1 抗菌肽概述

2 鱼类抗菌肽研究概况

3 鱼类hepcidin研究进展

4 选题依据及研究意义

实验部分

第一部分 鲤鱼 hepcidin cDNA 序列的克隆与序列分析

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 鲤鱼 hepcidin 基因组 DNA 序列的克隆和基因结构的分析

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 Hepcidin mRNA 在鲤鱼不同组织的分布及细菌刺激后的变化

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第四部分 鲤鱼 hepcidin 在大肠杆菌 AD494 中的表达和活性检测

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

结 论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢