斜带石斑鱼抗菌肽Hepcidin基因克隆、重组表达及口服免疫研究

摘要

Hepcidin是一类富含半胱氨酸残基的抗菌肽家族，现在已经被证实存在于多种鱼类中并且有多变体现象。Hepcidin具有广谱的抗微生物、抗病毒和肿瘤细胞的活性，还是维持机体铁稳态的重要的调控因子。鱼类Hepcidin在水产养殖中具有较广阔的应用前景。本研究通过分子生物学技术，从我国海水养殖斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）中获得抗菌肽Hepcidin基因，并揭示其表达特性，丰富我们对斜带石斑鱼先天免疫系统和先天免疫机制的认识。在此基础上，利用基因工程表达技术建立斜带石斑鱼Hepcidin的高效表达载体，研究其基因表达产物的抗菌活性，并研究口服灌胃表达产品对斜带石斑鱼的生理影响。主要研究成果如下:
　　 1.克隆获得源于斜带石斑鱼Hepcidin基因序列。利用分子生物学技术从海水养殖斜带石斑鱼肝脏RNA中克隆获得3条Hepcidin基因变体，EC-Hepcidin1、EC-Hepcidin2和EC-Hepcidin3。通过RACE技术获得了这3条变体的全长cDNA序列。从斜带石斑鱼肝脏基因组DNA中克隆获得了这3条变体的基因组DNA序列以及EC-Hepcidin1和EC-Hepcidin3基因组DNA上游调控区序列。这3条Hepcidin变体基因序列和基因结构有很高的相似性，均由3个外显子和2个内含子组成。生物信息学分析表明这3条Hepcidin变体编码的多肽均由信号肽、前导肽和成熟肽组成。成熟肽中均含有4个半胱氨酸残基，并且处于保守位点上。
　　 2.揭示了EC-HepcidinmRNA的体内组织器官分布和在病原诱导下的表达特性。利用Real-timePCR检测EC-HepcidinmRNA在斜带石斑鱼各组织器官中的分布，结果显示在所有测定的组织器官中均有检测到EC-Hepcidin的表达，其中肝脏的表达量最高，是在其他组织器官中表达量的3000-1000000倍。揭示了EC-Hepcidin是斜带石斑鱼肝脏特异性表达的基因。检测了细菌感染后斜带石斑鱼肝脏中EC-HepcidinmRNA的表达变化。健康的斜带石斑鱼在经过腹腔注射后，在细菌感染、福尔马林灭活菌刺激和生理盐水对照3个处理组中，肝脏EC-HepcidinmRNA均受到细菌和灭活菌不同程度的诱导而上调表达，分别在处理后12-24h及12h达到最高点。说明Hepcidin是斜带石斑鱼先天免疫的重要效应分子，可以在抵抗外界刺激的过程中起到重要作用，对机体起保护作用。
　　 3.重组表达获得EC-proHep3原核表达产物，研究其体外抗菌活性和杀菌动力学曲线。优化条件得到pET-28a/EC-proHep3(Rosetta)原核表达体系，可获得可溶性重组蛋白EC-proHep3，经一次亲和纯化后即获得目的蛋白纯品，分子量为12kDa，产量32.4mg/L菌液。体外抗菌实验结果显示，原核表达EC-proHep3能选择性地抑制革兰氏阳性和阴性菌，杀菌动力学曲线显示12μM的纯化重组蛋白EC-proHep3能够在60min杀灭全部金黄色葡萄球菌，30min杀灭全部施氏假单胞菌。
　　 4.揭示EC-Hepcidin蛋白体内组织器官分布特点。利用EC-proHep3重组表达纯化产物免疫Balb/c小鼠制备EC-proHep3多克隆抗体。通过间接ELISA法和westernblot法对抗体效价和抗体特异性进行检测，结果显示EC-proHep3多克隆抗体具有较高效价，可特异与EC-proHep3重组表达产物结合，满足后续实验需要。利用EC-proHep3抗体，通过SDS-PAGE、Westernblot检测了EC-Hepcidin蛋白体内组织器官表达情况，发现在肝脏和肠道可检测到Hepcidin蛋白。其中肝脏检测到前多肽原和前体肽蛋白两种形式的Hepcidin，而肠道检测到较多Hepcidin前体蛋白。
　　 5.口服EC-proHep3重组纯化产物，分析鱼体免疫基因和铁调节相关基因mRNA表达情况，并揭示单次灌胃EC-proHep3不会对机体造成氧化损伤和组织结构损伤。使用Real-timePCR检测口服灌胃EC-proHep3重组纯化产物0h、3h、6h、12h、24h和48h免疫相关基因TNFα-1、TNFα-2、IL1β、IL8和P65在肠道器官中的表达状况，结果表明所测定的免疫相关基因的口服抗菌肽组与溶剂PBS组没有显著性差异。通过对肝脏和肠道铁代谢相关基因FerroportinmRNA的检测发现，肝脏中Ferroportin在3-24h呈现出先抑制而后逐渐升高的趋势，48h达到最高。肠道Ferroportin基因在3h被显著抑制，并继续呈现基因表达下调的趋势。通过血清MDA的检测和肠道组织切片HE染色观察得到，单次灌胃EC-proHep3蛋白100μg/尾，血清中MDA含量无显著变化，肠道组织结构未受到影响。

目录

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摘要

第一章 绪论

第一节 抗菌肽的研究进展

1．1 抗菌肽的来源

1．2 抗菌肽的理化性质与结构特征

1．3 抗菌肽的功能及机理

第二节 Hepcidin的研究进展

2．1 Hepcidin的结构特征

2．2 Hepcidin在组织器官中的分布

2．3 Hepcidin的功能

第三节 抗菌肽的应用及人工合成抗菌肽的常用方法

3．1 抗菌肽在医学上的应用

3．2 抗菌肽作为饲料添加剂在动物养殖的的应用

3．3 人工合成抗菌肽的常用方法

第四节 本研究的技术路线、目的和意义

4．1 技术路线

4．2 研究目的和意义

第二章 斜带石斑鱼Hepcidin基因的克隆与序列分析

第一节 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

第二节 结果

2．1 总RNA的提取

2．2 斜带石斑鱼Hepcidin基因的扩增

2．3 EC-Hepcidins全长cDNA序列的扩增

2．4 斜带石斑鱼基因组DNA的提取

2．5 EC-Hepcidins基因组DNA的扩增和序列分析

2．6 EC-Hepcidins基因组DNA上游调控区序列的扩增和序列分析

2．7 EC-Hepcidins基因序列推导的氨基酸序列的分析

2．8 推导的EC-Hepcidln3氨基酸序列与其他已知Hepcidin氨基酸序列的多序列对比和系统进化树分析

第三节 讨论

3．1 连接头特异扩增目的片段的应用

3．2 含4个半胱氨酸Hepcidin成熟肽分子内二硫键的连接方式

3．3 Hepcidin的进化

3．4 上游调控序列的分析

第三章 斜带石斑鱼Hepcidin基因在体内各组织器官的分布与细菌感染诱导下的表达特性研究

第一节 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

第二节 结果

2．1 健康组各组织器官总RNA的提取

2．2 EC-Hepcidin基因和β-actin基因的扩增

2．3 Real-time PCR体系的建立

2．4 Real-time PCR检测EC-Hepcidin mRNA在正常斜带石斑鱼各组织器官中的分布

2．5 Real-time PCR检测EC-Hepcidin mRNA在细菌感染斜带石斑鱼肝脏中的表达特性

第三节 讨论

3．1 实时荧光定量PCR方法

3．2 斜带石斑鱼Hepcidin基因变体与引物设计

3．3 斜带石斑鱼Hepcidin基因的表达特性

第四章 斜带石斑鱼Hepcidin3基因的重组表达及表达产物抗菌活性的研究

第一节 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

第二节 结果

2．1 EC-proHep3的原核表达

2．2 重组蛋白EC-proHep3的抗菌活性

2．3 EC-proHep3的真核表达

第三节 讨论

3．1 Hepcidin前体肽的表达

3．2 大肠杆菌密码子

3．3 表达产物的可溶性

3．4 融合表达和非融合表达

3．5 EC-proHep3的抗菌活性

第五章 重组EC-proHep3小鼠抗血清的制备与EC-Hepcidin体内蛋白分布研究

第一节 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

第二节 结果

2．1 ELISA测定血清效价

2．2 Western Blot检验抗体阳性反应

2．3 斜带石斑鱼各组织蛋白表达情况分析

2．4 EC-Hepcidin蛋白组织表达差异分析

第三节 讨论

3．1 EC-proHep3的免疫原性

3．2 EC-proHep3抗体的特异性

3．3 生物体内Hepcidin的存在形式及蛋白分布

第六章 口服重组EC-proHep3抗菌肽对斜带石斑鱼免疫功能及组织形态影响研究

第一节 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

第二节 结果

2．1 斜带石斑鱼免疫相关基因、铁代谢相关基因及内参基因扩增

2．2 实时荧光定量检测基因表达方法的建立

2．3 口服EC-proHep3斜带石斑鱼肠道和肝脏总RNA的提取

2．4 口服EC-proHep3后免疫相关基因表达情况分析

2．5 口服EC-proHep3后铁代谢相关基因表达情况分析

2．6 斜带石斑鱼血清丙二醛(MDA)测定

2．7 口服EC-proHep3后肠道组织形态学分析

第三节 讨论

3．1 Hepcidin对免疫相关基因的影响

3．2 氯化胁迫与丙二醛(MDA)

3．3 EC-proHep3抑制Ferroportin mRNA表达

第七章 结语

第一节 研究成果

第二节 主要创新点

第三节 展望

参考文献

在学期间参加的科研项目及成果

致谢