基于FRET原理构建金纳米猝灭的荧光探针实现活细胞中葡萄糖的检测

摘要

半导体纳米粒子或量子点具有独特的光物理学特点，比如量子点的发射波长可通过控制它的大小和组成来调谐，高的荧光量子产率，抗光漂白能力强等。正是由于这些优点，量子点被广泛的应用于生物传感中的荧光标记。将生物材料修饰在纳米颗粒的表面上就可以合成新型的多功能纳米生物复合物。纳米荧光探针作为一种新型的探针，它所特有的量子尺寸效应和小的颗粒尺寸使之呈现出许多与同质单个分子或大块物体不同的光学性质，已经被成功应用于生物样品检测及活体细胞成像中。最近，由蛋白质修饰的纳米颗粒组装的生物纳米传感器已经引起了广泛的关注，例如，半导体量子点已经被作为一种极好的材料用于酶反应的生物分析和应用当中。因此，设计具有良好性能的新型荧光纳米生物传感器用来实现生物活性分子或细胞内活性物质的分析和检测已经成为科学工作者的巨大挑战。
　　荧光共振能量转移(FRET)作为重要的光物理技术已广泛应用于生物大分子之间距离的定性、定量检测。荧光共振能量转移的效率决定于供体受体之间的距离及其光谱重叠程度。其中，能量给予者为供体(donor)，荧光素量子产率高，是最常用的供体分子。能量接受者为受体(acceptor)，受体可发射自己的特征荧光(荧光增强)，也可作为猝灭剂不发荧光(荧光猝灭)，不产生荧光的受体其优势在于能够减少可能由受体本身直接产生的荧光背景的干扰。
　　作为一种荧光猝灭剂，金纳米颗粒可以有地猝灭荧光团的荧光。纳米金具有比较宽的猝灭范围、对荧光试剂高的猝灭效率以及良好的稳定性，可以提高FRET过程的灵敏度和特异性，使其成为一个研究和应用的热点。与传统的有机猝灭剂相比，金纳米粒子具有特殊的结构特征和光学性质，低的毒性以及好的生物相容性，所以金纳米作为一种极好的猝灭剂已经开拓了高灵敏度检测生物活性分子的前景葡萄糖是一种重要的生物活性物质，对细胞的健康生长起着非常重要的作用。葡萄糖的缺乏或过量都会对体内的新陈代谢产生不利的影响。目前有很多报道发现相对于正常细胞来说癌变细胞的代谢要消耗更多的葡萄糖。这其中的原因到目前为止还不是很清楚，但是癌细胞的糖代谢旺盛这一点是大家普遍认同的。目前，已经报道许多种有关葡萄糖含量的检测方法。其中，基于右旋糖酐、葡萄糖与葡萄糖氧化酶的竞争性结合的荧光检测方法由于其具有良好的选择性和较低的损伤度已经被广泛地应用于葡萄糖的检测当中。但是这些方法的检测限一般不高，而且毒性问题依然存在，限制了生物样品葡萄糖含量的直接检测，从而限制了细胞信号转换及细胞成像等方面的应用，所以设计一种稳定的高选择性的纳米荧光探针用于活细胞中葡萄糖的成像是非常有意义的。本文主要开展了以下两部分的研究工作:
　　(一)基于荧光共振能量转移原理(FRET)设计了一种简单的有效的荧光纳米探针用于葡萄糖的检测。探针的思路源于葡萄糖与 apo-葡萄糖氧化酶(apo-GOx)是特异性结合的，其结合力大于右旋糖酐(Dextran)与 apo-GOx的结合力。探针选择apo-GOx-Dextran作为发生 FRET的载体，FITC-Dextran作为能量供体，apo-GOx修饰的金纳米颗粒(AuNPs)作为能量的受体。在体系中不存在葡萄糖的时候，由于apo-GOx与 Dextran之间具有结合力，使得 Dextran-FITC与 AuNPs-apo-GOx相互靠近，满足能量共振转移的条件，在FITC的激发波长下激发时，FITC发射的荧光被金纳米粒子吸收，显示为荧光猝灭。当加入葡萄糖时，葡萄糖会与 Dextran竞争与 apo-GOx结合，使得FITC-Dextran与 AuNPs-apo-GOx远离，能量转移消失，FITC的荧光信号恢复。实验结果显示在优化的实验条件下，荧光光谱分析表明荧光强度随葡萄糖浓度的逐步增大而成线性增强，线性范围为20 nM-0.2μM。同时，该探针具有高的灵敏度和选择性，检测限为5 nM。细胞中存在的其它糖类和大多数生物物种不会对它的测定产生影响，该纳米探针成功应用于活细胞中葡萄糖的成像。
　　(二)基于两种不同尺度的金纳米构建的荧光探针实现活细胞中葡萄糖的检测。2 nm的巯基十一酸修饰的金纳米(LAuND)修饰上 apo-GOx作为供体，10 nm的Dextran修饰的金纳米颗粒(Dex-Au-NP)作为受体。由于葡萄糖和Dextran与 apo-GOx的竞争性结合，当葡萄糖存在时，葡萄糖与 apo-GOx特异性结合竞争下来Dextran，导致 LAuND荧光的恢复。根据荧光强度的变化来检测葡萄糖，进而实现活细胞中葡萄糖的成像。

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第一章 绪论

第一节 半导体量子点的基本特点及其光学性质

第二节 半导体量子点在生物分析中的应用

第三节 葡萄糖的体内代谢及其检测方法概述

参考文献

第二章 基于 FRET 原理构建金纳米猝灭荧光素的荧光探针用于活细胞中葡萄糖的检测

1. 引言

2．实验部分

3．结果与讨论

4. 结论

参考文献

第三章 基于两种不同尺度的金纳米构建的荧光探针用于活细胞中葡萄糖的检测

1．引言

2．实验部分

3. 结果与讨论

4．阶段性结论和建议

参考文献

作者发表的学术论文、专利及参加的课题

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