利用油体蛋白表达系统表达人成骨蛋白的研究

摘要

人成骨蛋白-1(Human Osteogenic Protein1，hOP-1)，或称骨形成发生蛋白7(Bone Morphogenetic Protein7，BMP7)，是TGF-β超家族中的一员，具有诱导IOPC(inducible osteogenic precursor cells)类细胞向成骨细胞方向转化的蛋白质，具有广阔的临床应用前景。由于人骨源有限，直接从人骨中提取人成骨蛋白受到了限制，影响了临床应用。随着基因工程技术的发展，异源表达成骨蛋白成为可能。
　　植物生物反应器已广泛应用于外源高经济附加值的药用蛋白、脂类及一些次生代谢产物等生物制剂的生产，其成本低，不仅能满足人们生产和生活的需要，而且可以拓宽植物的应用范围。利用植物油体表达系统表达人成骨蛋白有非常广泛的前景。植物种子中油体蛋白(oleosin)是一类镶嵌在油体表面的小分子碱性蛋白，在种子中高水平表达并大量积累，由于其脂溶性的特点，很容易将油体蛋白与种子中其他蛋白分开。而且当外源小分子量蛋白插入到油体蛋白的N端或C端后，不会影响到油体蛋白在植物油体上的定位及表达，而且外源蛋白本身也能高水平表达。在油料作物种子中利用油体蛋白做载体生产药用蛋白及其它有用物质，具有独特的优越性。
　　花生作为我国最重要的油料作物之一，既可以榨油和深加工，又可以生食，更为重要的是油体蛋白在花生种子中高水平表达并大量积累。所以，在花生种子中利用油体蛋白表达人成骨蛋白将具有广阔的前景。本研究初步建立了花生油体蛋白表达体系表达人成骨蛋白的植物生物反应器体系，并且在转基因烟草种子中进行了表达，为在花生中转化及利用该体系大规模生产人成骨蛋白和其它外源蛋白奠定了基础。研究内容和结果如下:
　　人成骨蛋白-1基因密码子的优化:根据植物中密码子表达的偏好性，将本实验室已经克隆得到的人成骨蛋白-1基因的cDNA序列通过软件分析进行优化后重新合成序列，为在植物中高效表达人成骨蛋白奠定了基础。
　　人成骨蛋白-1的原核表达:首先将人成骨蛋白-1基因的全长cDNA序列(420 bp)，连接到原核表达载体PET28a上，在大肠杆菌中进行原核表达，实验结果显示人成骨蛋白-1能够正确表达，融合蛋白分子量约为15.7 KD，与预期大小基本一致。原核表达的蛋白可用于抗体制备及后期成骨蛋白检测研究。
　　花生油体蛋白基因和启动子的克隆:根据NCBI中花生油体蛋白的基因序列，设计引物，克隆得到了花生油体蛋白的全长基因及其启动子。
　　植物表达载体的构建和优化:将人成骨蛋白基因连接到花生油体蛋白基因的3’端，在油体蛋白基因和成骨蛋白基因间插入肠肽酶基因序列，便于后期重组蛋白从油体蛋白上的分离。构建由花生油体蛋白基因启动子驱动的“花生油体蛋白-肠肽酶-成骨蛋白”的融合植物表达载体。本研究还将pCAMBIA1301、pCAMBIA1302两个载体进行改造优化，将两个载体中的潮霉素(Hyg)抗性改为卡那(Kan)抗性，以降低研究及开发成本。
　　遗传转化和表达验证:利用叶盘转化法转化烟草，通过RT-PCR的方法检测了人成骨蛋白基因在转基因烟草中的表达情况。结果表明在叶、花中没有检测到融合蛋白基因的表达，在种子中高水平表达。为了进一步验证结果，可以对pCAMBIA1301-oleosin-BMP-7-GUS和pCAMBIA1302-oleosin-BMP-7-GFP侵染后得到的转基因阳性植株进行GUS染色显示和GFP亚细胞定位来反映融合蛋白的表达情况。

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英文缩略表

第一部分 文献综述

1 植物生物反应器

2 油体蛋白表达系统概述

3 人成骨蛋白概述

4 本实验的研究意义

第二部分 实验论文

1 材料与方法

2实验结果

3讨论

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文