利用昆虫杆状病毒系统表达人KCTD9蛋白和人fgl2蛋白及人fgl2凝血酶原酶活性研究

摘要

背景及目的:
　　 根据世界卫生组织截止到2005年的统计数据，全球乙型肝炎病毒感染者总数约20亿，其中3.5亿人为慢性乙肝患者，每年大约有60万人死于乙型肝炎。0.1[％]～0.6[％]HBV急性感染者出现重症肝炎，死亡率高达70[％]～90[％]。亚洲是乙肝病毒肆虐的重灾区，全球2/3以上的慢性乙肝患者生活在亚洲。而我国是HBV感染高发地区，仅HBV携带者就有1.3亿，人群携带率约10[％]，所以我国重症肝炎很常见。重症肝炎以急剧广泛性肝细胞坏死为主要病理特征，临床上可表现为严重的消化道症状、高度黄疸、肝性脑病、出血、肝肾综合症、继发感染。该病病情严重，发展迅猛，发病机制尚不完全明了，临床缺乏特异、有效的治疗靶点和干预手段，死亡率高，而幸存者易发展成肝炎后肝硬化，生活质量显著下降。因此探索重症肝炎发病机制、预防并阻止重症肝炎的疾病演变的关键环节是我国急需解决的课题。
　　 本实验室利用基因芯片技术对重症肝炎相关基因进行筛选，发现慢性重症肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)的基因表达谱与轻度慢性肝炎患者相比，差异性表达基因达300余个，其中2个与钾离子通道相关的新基因，KCTD9(potassium channel tetramerisation domain containing 9)和KCNJ15(potassium inwardly-rectifying channel，subfamily J，member 15)，在慢性重症肝炎患者中分别上调约6倍和7倍，并收集大量样本经实时定量PCR证实结果可靠。33.3[％]HBV感染患者PBMC中KCTD9 mRNA高表达，以重症肝炎组表达上调最显著，且这部分患者PBMC中KCTD9 mRNA表达水平与其肝功能损害程度呈正相关。同时新近发现的纤维介素蛋白[Fibrinogen-like protein 2(fgl 2)/fibroleukin]属纤维蛋白原相关蛋白超家族，又称fgl2凝血酶原酶，具有丝氨酸蛋白酶活性可直接催化凝血酶原转变成有活性的凝血酶，从而快速启动凝血反应。在鼠肝炎3型病毒(murine hepatitis virus-3，MHV-3)感染暴发型肝炎模型中，鼠fgl2凝血酶原酶(mfgl2)选择性高度表达于病变肝组织，应用中和抗体和mfgl2特异性的反义RNA可减轻肝脏疾病严重程度并显著降低死亡率。同时在mfgl2基因敲除的暴发型肝炎小鼠模型中，生存率亦可从0[％]上升至40[％]。我们在重症乙型肝炎病人的肝脏组织发现人fgl2凝血酶原酶高度表达。因此获得持续来源的人KCTD9蛋白和人fgl2蛋白对其功能进行深入研究很有意义。故我们选择BaculoDirect?这一最新型昆虫－杆状病毒蛋白表达系统表达人KCTD9蛋白和人fgl2蛋白。
　　 方法:
　　 采用PCR法从扩增出hKCTD9以及hfgl2基因片段，并分别连接至pENTR/D-TOPO载体，转化DH5a感受态细菌，提取连接后的质粒并确认序列正确。将入门克隆pENTR/D-TOPO-hKCTD9/hfgl2质粒与线形杆状病毒DNA连接后即表达克隆(重组杆状病毒DNA)，转染易感细胞系昆虫Sf9细胞，待重组杆状病毒在细胞内包装好，收集并感染新一批Sf9细胞以扩大培养。电子显微镜观察感染后Sf9细胞中病毒颗粒的形成；激光免疫共聚焦技术检测感染后昆虫细胞表达hKCTD9蛋白的细胞定位；Western Blot分析融合蛋白hKCTD9以及hfgl2的表达。
　　 结果:
　　 PCR法证实重组入门克隆pENTR/D-TOPO-KCTD9/hfgl2和表达克隆(杆状病毒DNA)中hKCTD9/hfgl2融合基因构建正确，入门克隆质粒经测序证实hKCTD9/hfgl2基因序列正确；透射电子显微镜观察发现被感染的Sf9细胞核中存在大量的杆状病毒，核涨大、透亮，核中可见病毒的衣壳、包膜以及杆状病毒特有的核多角体蛋白；激光共聚焦显微镜证实感染重组杆状病毒的Sf9细胞核内可见绿色荧光，而未感染Sf9细胞中未见绿色荧光，提示前者有目的基因表达；Western Blot进一步显示hKCTD9蛋白大小约为55KD，与基因库中预测蛋白大小43KD不一致，与人PBMC中KCTD9蛋白大小一致。表达的hfgl2融合蛋白利用Western Blot检测到跨模型和分泌型蛋白，大小分别为63KD和50KD，且跨模型hfgl2蛋白具有凝血功能。
　　 结论:
　　 ①利用昆虫杆状病毒表达系统成功地表达了潜在重肝相关基因hKCTD9蛋白、hfgl2蛋白，为进一步探讨该基因在重症乙型肝炎发生发展中的作用及机制提供了有力的工具。
　　 ②hKCTD9单克隆抗体、多克隆抗体以及标签抗体均检测到表达系统表达的hKCTD9蛋白的大小约55KD与基因库中预测大小43KD相差12KD，考虑表达系统表达的KCTD9蛋白翻译后存在加工修饰。由于杆状病毒-昆虫表达系统表达的蛋白更接近天然蛋白的生物学功能，因此该系统表达的hKCTD9蛋白的加工修饰也与体内更为接近。故通过对表达蛋白结构及修饰的研究为其生物学功能研究提供参考。
　　 ③hfgl2在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达并具有生物学活性，为进一步研究hfgl2跨膜型以及可溶性蛋白功能提供了工具，亦可应用于开发重症肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒。