异源表达甲基转移酶基因对植物耐逆性的影响

摘要

甲基溴作为一种土壤熏蒸剂被广泛应用于大棚温室等设施农业，但是由于CH3Br对大气平流层的臭氧有着极强的破坏作用，联合国蒙特利尔公约要求发展中国家必须在2015年停止使用，因此迫切需要开发一种能够满足环境要求的新型甲基溴替代技术。
　　 对于卤代甲烷的研究除了在生态学和环境保护方面有重要的价值，他的源和汇及其酶促反映机制的研究也具有重要的意义。卤代甲烷的来源是丰富多样的，除了甲基溴熏蒸剂在土壤中的大量使用外还包括海水的分解释放、生物燃烧释放、大量燃料的燃烧产生、微生物和陆地植物的产生释放等。MeX的生物合成酶促反应：SAM+X-(Cl-，Br-，I-)→CH3X+S-adenosylhomocysteine(S-腺苷高半胱氨酸)，该反应是由一种卤代甲烷甲基转移酶(methyl chloride transferase MCT)催化完成的。卤素底物对酶的亲和性排列顺序为I->Br->Cl-，但是氟离子不能进行该酶促反应。根据甲基碘的释放量测定植物是否含有卤代甲烷甲基转移酶活性的实验推测，大部分高等植物都具有MCT酶活性。利用基因工程的手段，把编码MCT酶的基因转化到对氯离子敏感的作物中，有可能提高植物的耐盐性。模式植物拟南芥也产生和释放卤代甲烷，而行使此功能的主要的酶是由HOL(HARMLESS TO OZONE LAYER)基因编码的，该酶属于甲基转移酶家族，能催化依赖SAM底物的Cl-、Br-、I-的甲基化，对该基因的系统发生学分析表明在维管植物中广泛存在着产生卤代甲烷的能力。
　　 植物寄生线虫是一种危害农作物的重要病原生物，其对农作物的危害已经超过了细菌和病毒，在引起植物侵染性病害的四大病原中仅次于真菌。它具有在自然界分布广泛、种类繁多等特点，同时它能促使真菌和细菌易于侵染植物，从而成为诱发植物病害的重要原因之一。目前对各种农作物根结线虫防治的方法有：药物(如甲基溴熏蒸)防治、生物制剂(如线虫生防细菌)防治等。
　　 在之前的研究中，根据高等植物能够天然产生甲基卤化合物的特点，将利用RACE技术从拟南芥、盐芥、盐地碱蓬叶中克隆到卤代甲烷甲基转移酶基因AtMCT、ThMCT和SsMCT，通过转基因技术将基因转入经济作物烟草，经Southern、Northern分析表明外源基因已经导入并在烟草中实现了异源表达。
　　 本实验用不同离子浓度的培养液处理野生型和AtMCT转基因烟草，测定其卤代甲烷释放量、氯离子含量、钠钾离子含量、叶绿素含量及生物量等指标。转基因烟草的卤代甲烷释放量明显高于野生型对照。在不同钠离子和氯离子浓度处理下，转基因烟草叶绿素含量增高，钠离子含量降低，钾离子含量升高，比野生型烟草的耐逆性增强。本研究的目的是实现烟草在不受Cl-胁迫的前提下施用经济实惠的KCl肥料，从而提高植物体内的钾离子含量，以改良转基因烟草的品质，同时实现植物自身释放的CH3Br能够抑制植物线虫病害，减少外源化学药品的使用。
　　 把三种基因在原核细胞中表达，发现AtMCT大部分以可溶性蛋白形式存在于裂解细胞的上清中，与其同源性很高的ThMCT一部分表达为亲水性蛋白、一部分表达为疏水性蛋白，而碱篷的SsMCT则以包涵体的形式存在沉淀中。为了寻找造成原核表达时AtMCT和ThMCT在上清中表达而SsMCT以包涵体的形式在沉淀中表达的区别，将ThMCT序列上两个与AtMCT有差别的两个氨基酸位点进行了点突变和双突变，经过改造的ThMCT基因ThA32E，ThL49Q，ThA32EL49Q表达的蛋白在存在形式上有了较大的变化，均变为了大部分可溶的亲水性蛋白。
　　 用Ni-组氨酸吸附琼脂糖珠亲和层析法纯化原核表达的可溶性融合蛋白AtMCT-His、ThMCT-His、ThMCTA32E-His、ThMCTL49Q-His、ThMCTA32EL49Q-His以及包涵体蛋白SsMCT-His，均得到单一条带的融合蛋白。
　　 通过与底物反应时甲基卤化物的释放量来测定卤代甲烷-甲基转移酶活性，在只有酶和底物反应的情况下，SsMCT酶对碘的活性很高，而盐处理后，大量的氯离子对碘离子形成竞争性抑制，三种酶对碘的合成活性都有所降低，AtMCT和ThMCT对甲基氯的催化作用迅速增强。被改造的三个MCT对甲基碘的合成效率受到盐浓度的影响，LQMCT和AEMCT在只有酶和底物反应的条件下酶活性较高。随着盐浓度的升高，AELQ对氯的酶活性大幅度提高，说明这两个氨基酸位点在调节酶活性上起到重要作用。
　　 AtMCT基因在烟草中的异源表达赋予烟草抗盐耐氯及抗线虫能力，AtMCT转基因作物的应用有望成为甲基溴土壤熏蒸的代替技术，开辟了一条害虫生物防治的新途径。