黑毛雪兔子表皮毛发育相关基因ShTTG1的克隆及功能研究

摘要

黑毛雪兔子（Saussurea hypsipeta Diels），属菊科（Compositae）风毛菊属（Saussurea DC.），是一种生长于青藏高原地区的珍稀、濒危药用植物。同时，它又是一种典型的高山植物。植株密被表皮毛是黑毛雪兔子最具有代表性的形态特征，并且是黑毛雪兔子对极端环境适应的一种特殊结构。研究黑毛雪兔子表皮毛的形成和发育过程，对揭示高山植物适应环境的特殊机制将具有重要的理论意义。为此，本研究以黑毛雪兔子作为实验材料，在建立起黑毛雪兔子离体再生体系的基础上，通过RT-PCR，结合RACE技术，克隆了与表皮毛发育相关的基因TTG1，并研究了该基因的功能。 主要研究结果如下： 1. 以野生苗叶片为外植体，通过愈伤组织途径建立了植株再生体系。以MS为基本培养基，附加2.0 mg·L-1 2,4-D和0.5 mg·L-1 6-BA，适于愈伤组织的诱导；愈伤组织在含有0.5 mg·L-1 2,4-D的MS培养基上继代后，在附加1.0 mg·L-1 6-BA和0.2 mg·L-1 NAA的MS培养基上，愈伤组织分化率为84.45%；在附加0.2 mg·L-1 IAA和0.2%活性炭的1/2 MS培养基上，再生芽的生根率为82.2%；再生植株移栽到盆土中，大约有16.7%的苗存活，并能够正常的生长。 以再生苗叶片为外植体，通过不定芽的直接诱导建立了植株再生体系。以MS为基本培养基，附加0.5 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA，适于叶片不定芽的直接诱导，平均每个外植体产生4.7个不定芽。 2. 克隆得到黑毛雪兔子TTG1基因。TTG1基因cDNA全长1378 bp，包含1014 bp的开放阅读框，118 bp的5’端非编码区，225 bp的3’端非编码区和21 bp的ploy（A）尾巴。该基因共编码337个氨基酸残基，分子量为37.47 kDa，等电点 4.82。同源比对显示，推导出来的氨基酸序列与同一属植物水母雪莲（Saussurea medusa）的同源性为95.25%，与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）、黄瓜（Cucumis sativus）的同源性分别为73.91%、73.33%和74.78%。黑毛雪兔子TTG1基因的氨基酸序列有5个WD40 repeat，说明该基因可能编码一种WD40蛋白，将该基因命名为ShTTG1（MF805763）。 同时，克隆得到黑毛雪兔子ShTTG1基因的一对等位基因，命名为ShTTG1a （MG564780）和ShTTG1b（MG564781），基因长度均为1328 bp，CDS区为1014 bp，编码337个氨基酸；等位基因之间有3个核苷酸差异位点，在CDS区有1个差异位点，导致所编码的多肽序列在250位点上的氨基酸存在差异，ShTTG1a为亮氨酸，ShTTG1b为甲硫氨酸。 3. 采用qRT-PCR技术，检测黑毛雪兔子5个内参基因（Actin、18S rRNA、GAPDH、EF1α和TUA）在不同组织中，以及低温胁迫（4℃）和紫外胁迫处理下叶组织中的表达情况。在Delta Ct、geNorm、Best Keeper和Norm Finder软件分析的基础上，利用Ref Finder在线工具综合分析5个内参基因的稳定性。结果表明，在不同组织中表达最稳定的是GAPDH；在低温胁迫下表达最稳定的是18S rRNA；在紫外胁迫下表达最稳定的是Actin。为黑毛雪兔子相关基因的表达研究提供了较稳定的内参基因。 以GAPDH作为内参基因，检测ShTTG1基因在黑毛雪兔子根、茎、叶和花中的表达情况。结果表明，ShTTG1基因在4种组织中都有表达，其中在叶中的表达量最高。 将ShTTG1基因连接到pColdⅠDNA表达载体，构建了原核表达载体pColdⅠDNA::ShTTG1，并导入到BL21（DE3）大肠杆菌中进行原核表达，表达产物用 SDS-PAGE 电泳分析。结果表明，目的蛋白在大肠杆菌中表达，表达蛋白的分子量接近40 kDa，与预测的融合蛋白分子量大小相符。 4. 构建了ShTTG1基因的超表达载体35S::ShTTG1，在根癌农杆菌介导下，将目的基因 ShTTG1 转入本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中。通过 PCR 和RT-PCR检测，获得3株转基因烟草植株。形态学比较表明，转基因植株叶柄和叶片上的表皮毛较长，且在表皮毛密度上与对照有显著差异。 构建了ShTTG1基因的亚细胞定位载体35S::ShTTG1-GFP。共聚焦结果显示， ShTTG1蛋白定位于细胞核中，这符合转录因子的特征。 将 35S::ShTTG1-GFP 载体转化本氏烟草。在转基因烟草叶片中，除了叶脉外，表皮毛中也有较强的荧光信号，推测ShTTG1基因与表皮毛发育有关。 对黑毛雪兔子进行了紫外和低温胁迫处理。结果表明，在紫外处理下， ShTTG1基因的表达量在3 h后显著提高，之后下降。而在低温处理下，ShTTG1基因的表达量与对照组差异不显著，推测黑毛雪兔子的表皮毛可能是针对紫外辐射的一种适应结构。