单细胞内氧化还原相关活性小分子的原位动态分析与细胞功能的研究

摘要

氧化还原反应及其动态平衡是生物体内最基本、最重要的生物化学反应之一。细胞内氧化物质(如O2·-、H2O2、·OH、NO等)与还原物质(如GSH、NADPH、VitaminC等)的活性及相互间的比例决定细胞的氧化还原状态。细胞受到外界刺激或者发生病变过程中,氧化性物质或还原性物质表达过量会打破细胞的氧化还原平衡,发生氧化还原应激,并导致细胞及生物体的生理、病理发生变化。因此,对细胞尤其是单细胞内氧化还原态变化进行原位、动态分析具有重要意义和应用价值。 鉴于细胞内氧化还原反应对细胞增殖、分化、凋亡以及重大疾病发生、发展等过程的重要影响,为了发现细胞群体研究中因统计学检测而被掩盖的个体细胞内氧化还原的真实信息,进一步研究细胞的生理、病理过程。本论文开展了单细胞氧化还原状态原位动态分析新方法的研究,并初步研究了细胞氧化还原状态失衡与细胞功能的关联。论文主要包括以下四部分: 第一章绪论,首先简单介绍了细胞内氧化还原反应及其动态平衡的生物学意义,细胞内相关活性小分子与氧化还原态的关系,目前细胞内氧化还原相关活性小分子的分析现状。然后概述了微流控芯片分析系统的概念、组成及其在单细胞氧化还原状态分析研究进展。 第二章针对目前单细胞氧化还原动态分析缺少实验手段的问题,发展了一种能够支撑细胞输送、单细胞定位、培养、荧光标记和单细胞内氧化还原活性小分子原位成像检测等功能的微流控芯片-荧光成像分析系统。该系统主要由重力驱动、微流控芯片、温度、二氧化碳控制器和激光扫描共聚焦显微镜组成,通过不同结构芯片的对比实验,筛选出合适的芯片结构,并通过芯片通道温度校正、芯片上单细胞水平活性氧(ROS)荧光成像分析,考察了该系统的性能,为后续单细胞内氧化还原相关活性小分子原位动态分析奠定了基础。 第三章针对目前肿瘤热疗机制中群体细胞氧化还原态分析难以反映个体细胞真实信息的不足,利用微流控芯片-荧光成像分析系统结合实验室设计合成的新型近红外可逆荧光探针(Cy-O-Eb),建立了一种热诱导下单个MCF-7/MCF-10A细胞氧化还原态(GSH/H2O2)的动态分析方法。并通过细胞凋亡形态学观察及流式细胞术、免疫荧光成像、westernblot等手段探索了氧化还原失衡与细胞功能的关联。研究表明,所建方法具有多参数、高选择性、原位、动态实时等优点,将为单细胞水平氧化还原分析及其相关研究提供一种新途径。 第四章总结与展望,本文提供了一种可以支撑单细胞内氧化还原活性小分子原位动态分析的实验平台,明确了热诱导MCF-7细胞凋亡与线粒体内氧化还原态(GSH/H2O2)的失衡密切相关。而MCF-7细胞线粒体内氧化还原态(GSH/H2O2)的失衡是否由ROS升高直接导致的,以及氧化还原态(GSH/H2O2)对细胞功能的调控是否与钙离子通道有关,是需要进一步研究的。

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主要符号与缩写

第一章 绪 论

1细胞氧化还原状态的研究意义

2微流控芯片分析系统与芯片上的单细胞氧化还原状态研究进展

3本论文研究内容

参考文献

第二章 微流控芯片-荧光成像分析系统的设计与构建

1 引言

2实验部分

3结果与讨论

4总结

参考文献

第三章 单个MCF-7/MCF-10A细胞氧化还原态（GSH/H2O2）的原位实时分析及氧化还原失衡与细胞功能的关联

1引言

2实验

3结果与讨论

4总结

参考文献

第四章 总结与展望

4.1总结

4.2 创新点

4.3后续展望

作者发表的学术论文及参加的课题

致谢