PYK2在小鼠卵母细胞纺锤体组装过程中的功能研究

摘要

PYK2是一种非受体型的的酪氨酸激酶，属黏着斑激酶家族成员。其主要结构包括：N末端的FERM结构域,富含脯氨酸的结构域,C末端黏着斑靶点(FAT domain)以及FRNK结构域。PYK2有多个磷酸化的位点，包括Tyr402，Tyr579，Tyr580。其中，Tyr402位点可以接受细胞表面刺激发生自磷酸化,但Tyr579，580位点的活化需要二聚化以及钙离子通路的调节。研究发现，PYK2可以响应多种细胞内外信号而激活，参与多条信号通路的传递，在细胞增殖、迁移、凋亡等过程中发挥重要作用。
　　在本研究中我们应用细胞免疫荧光、抑制剂处理、Westernblot等方法对Tyr402位点磷酸化的PYK2（以下简称P-PYK2）在小鼠卵母细胞减数分裂纺锤体组装过程中的定位和功能进行了研究。结果发现:在小鼠GV期卵母细胞中，Tyr402磷酸化的PYK2主要集中在细胞核内,少量分布在细胞皮质区。随着GVBD的发生，目的蛋白分散到细胞质中，起初围绕在染色体周围，随着减数分裂的进行，活化的PYK2离开染色体，逐渐集中到卵细胞的两端，在MⅡ期卵子中，活化的PYK2定位在纺锤体的两极。当磷酸化PYK2与α-Tubulin共同标记时发现：微管蛋白在GBVD后开始围绕细胞染色体周围聚集成微管球，P-PYK2与α-Tubulin聚集生成的部位重合。随着卵子的成熟，染色体开始逐渐排列在赤道板上，微管蛋白逐渐呈束状垂直于赤道板排列。而此时，P-PYK2向纺锤体的两极移动，并逐渐聚集，而且始终与微管聚集发生部位密切相关。后期刚开始时，PYK2仍在第一次减数分裂纺锤体两极。末期，检测不到P-PYK2(Tyr402)的特异性聚集。到MⅡ期，卵母细胞成熟，纺锤体的形成一个梭形的结构，靠近细胞皮质区域。此时P-PYK2几乎全部定位在纺锤体的双极区域。
　　用共聚焦显微镜检测PYK2与γ-Tubulin的共同标记，发现P-PYK2与γ-Tubulin是一种共定位的位置关系，说明 PYK2可能作为微管组织中心的成分之一参与了纺锤体的组装。为了进一步研究PYK2与纺锤体组装的关系，我们用PYK2酪氨酸激酶抑制剂处理小鼠卵细胞，当P-PYK2(Tyr402)活性受抑制后，免疫荧光标记α-Tubulin显示小鼠卵母细胞中的纺锤体形态异常，与对照组相比，纺锤体的两极不能很好的聚合，一些卵母细胞内纺锤体的面积过大或过小。Western blotting等结果显示微管蛋白（α-Tubulin）表达量也受到显著影响。以上这些数据表明P-PYK2(Tyr402)表达受抑制后，纺锤体的组装也受到影响，不能形成正常的纺锤体结构。纺锤体的结构异常会导致染色体不能正常分离，细胞分裂迟缓。实验显示抑制剂处理卵子后，第一极体的排出率显著降低；抑制剂浓度越高，第一极体的排出率越低。
　　综合以上的实验结果，可以推测出 P-PYK2(Tyr402)在小鼠卵细胞成熟过程中可能起到与微管组织中心蛋白类似的作用，参与纺锤体的组装，进而调节减数分裂进程。

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第一章 论文综述

1.减数分裂过程中纺锤体的组装及其功能调控

1.1纺锤体的结构

1.2减数分裂过程中纺锤体的功能

1.3减数分裂过程中纺锤体组装

1.4减数分裂过程中MTOCs的结构与功能

1.5纺锤体正确排列组装的监测机制

1.6纺锤体稳定性的调节蛋白

2.酪氨酸激酶的结构、功能及在卵母细胞成熟过程中的作用

2.1 PKY2的结构

2.2 PKY2有关的信号途径

2.4 PYK2在卵细胞中的分布和功能

2.5其他PTK功能介绍

第二章 研究论文

1.引言

2.实验材料与方法

2.1.实验材料

2.2实验方法

3.实验结果

3.1 P-PYK2(Tyr402)在小鼠卵母细胞成熟过程中的定位

3.2小鼠卵母细胞成熟过程中P-PYK2(Tyr402)与α-Tubulin的定位关系

3.3小鼠卵母细胞成熟过程中P-PYK2(Tyr402)与γ-Tubulin共定位

3.4诺考达唑处理MⅡ期卵母细胞的对P-PYK2(Tyr402)的影响

3.5 P-PYK2(Tyr402)抑制剂处理对小鼠卵细胞纺锤体的影响

4.讨论分析

参考文献

致谢