中脑导水管周围灰质星形胶质细胞在大鼠束缚浸水应激中的作用

摘要

大鼠束缚浸水应激（RWIS）模型是刺激较强的复合应激模型。该应激模型是将大鼠四肢固定，之后浸入冷水（水温21±1℃），使其在短时间内被激怒，从而被迫接受躯体和心理双重刺激的复合应激模型。此模型可使大鼠胃肠机能紊乱，并导致其胃黏膜急性损伤，所以常用其来研究应激性胃黏膜损伤。本实验室先前的研究数据表明：大鼠在束缚浸水应激条件下，调节胃机能的神经主要是副交感神经系统（PNS）。迷走传入神经可将来自胃肠道和其他脏器的感觉信息传递至脑干，脑干孤束核（NTS）中的二级神经元将传来的信息进行整合，并可通过谷氨酸、GABA等作为神经递质将整合的信息传递至相关核团，例如臂旁核。臂旁核可经下丘脑和杏仁体传递至PAG。又有胡旺平等人的研究证明[1]，延髓头端腹外侧区（RVLM）和中脑导水管周围灰质（PAG）参与了心血管活动的调控，当慢性应激导致PAG内NO的含量降低时，其可激活RVLM的胆碱能发挥作用,进而共同调控和维系大鼠应激性高血压。PAG不但可以接收臂旁核，下丘脑，中央杏仁核，前扣带回皮层(ACC)，脑岛（INS）以及内侧前额叶皮层（PFC）的信息传入，而且其可将接收的信息经前扣带回皮层(ACC)传递至迷走神经背核（DMV），DMV再将其发出的迷走运动信息传递至胃肠道，进而调控胃肠道的功能。ERK1与ERK2是ERK家族研究最为彻底也是表达最为广泛的分子。ERK1/2被磷酸化激活后，由细胞质转移至细胞核内，之后与 cAMP反应元件结合，从而调节c-fos和Jun-B等的表达。我们的研究发现在RWIS过程中，不同脑区神经元内的c-Fos蛋白表达显著增多。而且，近年来的一些研究表明，ERK1/2信号通路与炎症、应激反应的调控关系密切，被认为是细胞信号传递通路的交汇点，那么，作为c-Fos蛋白表达的上游调控分子ERK1/2是否参与RWIS过程，起何作用，尚未见报道。那么：
　　1.中脑导水管周围灰质（PAG）中的星形胶质细胞是否参与RWIS所导致的胃黏膜损伤？
　　2.如果星形胶质细胞参与了RWIS,那么其与神经元又存在怎样的关系？
　　3.中脑导水管周围灰质（PAG）中的ERK1/2信号通道是否参与RWIS所导致的胃黏膜损伤？
　　为了解决以上的问题，设计实验如下：
　　1.大鼠随机分为对照组（RWIS0 h）和应激组（RWIS0.5、1、2、3、5h）其中，c-Fos蛋白的表达可作为神经元被激活的标志，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达可作为星形胶质细胞被激活的标志。本实验是通过免疫组织化学染色和蛋白质免疫印迹两种技术检测大鼠束缚-浸水应激不同时段中脑导水管周围灰质（PAG)中的c-Fos蛋白和GFAP的表达情况，从而探究PAG内神经元和星形胶质细胞是否参与了RWIS以及其应激不同时间段的变化规律。
　　2.将实验大鼠随机分为生理盐水对照组、L-AA给药组和ASO给药组。观察ASO给药组在抑制c-Fos蛋白的表达时，其对GFAP的表达是否有影响；观察L-AA给药组在抑制 GFAP的表达时，其对c-Fos蛋白的表达是否有影响。
　　3.大鼠随机分为对照组（RWIS0 h）和应激组（RWIS0.5、1、3、5h）通过免疫组织化学染色和蛋白质免疫印迹两种技术检测大鼠束缚-浸水应激不同时段对中脑导水管周围灰质（PAG)中p-ERK1/2（ERK1/2蛋白被激活的标志）的表达情况，从而探究 ERK1/2信号通路是否参与了RWIS以及其应激不同时段的变化规律;大鼠随机分为生理盐水对照组和PD98059给药组，观察PD98059给药组在抑制p-ERK1/2蛋白的表达时，其对c-Fos蛋白、GFAP的表达及胃溃疡指数是否有影响。
　　本实验研究结果如下：
　　1.束缚-浸水应激过程中，中脑导水管周围灰质（PAG）中的星形胶质细胞参与了应激所引起的胃黏膜损伤。实验结果表明，与对照组相比，在RWIS应激组中，中脑导水管周围灰质（PAG）单位面积内（0.01mm2）的c-Fos蛋白和GFAP蛋白均有增多，且差异显著，说明PAG中的神经元和星形胶质细胞参与了RWIS。
　　2.本实验发现注射星形胶质细胞的抑制剂L-AA之后，除星形胶质细胞的活
　　动被抑制外，神经元c-Fos蛋白的表达量也显著减少；注射c-Fos蛋白的抑制剂ASO之后，除神经元的活动被抑制外，星形胶质细胞 GFAP的表达量也显著减少，提示PAG内神经元和星形胶质细胞之间可能存在着交互关系。
　　3.束缚-浸水应激过程中，中脑导水管周围灰质（PAG）中的星形胶质细胞参与了应激所引起的胃黏膜损伤。实验结果表明，与对照组相比，在RWIS应激组中，观察到大鼠PAG内p-ERK1/2表达量显著增多，ERK1/2蛋白的特异性抑制剂PD98059能显著抑制c-Fos蛋白和GFAP的表达，说明PAG内ERK1/2蛋白信号通路也参与了束缚-浸水应激。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

符 号 说 明

文 献 综 述

综述一 应激和应激性胃黏膜损伤的研究进展

1 应激和应激性胃黏膜损伤

2 应激诱导c-Fos蛋白表达的研究进展

3应激诱导GFAP表达的研究进展

4应激诱导ERK1/2蛋白表达的研究进展

综述二 星形胶质细胞和神经元相互作用的研究

1 星型胶质细胞与神经元之间的相互作用

2 星型胶质细胞对神经元的调控

实 验 研 究

实验研究一 RWIS 不同时段中脑导水管周围灰质 c-Fos 蛋白和GFAP表达的研究

前言

1 实验材料

2 免疫组织化学染色技术的实验方法

3 蛋白质免疫印迹技术的实验方法

4 实验结果

5讨论

实验研究二 RWIS过程中星形胶质细胞和神经元相互关系的研究

前言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4讨论

实验研究三 RWIS不同时段中脑导水管周围灰质p-ERK1/2表达的研究

前言

1 实验材料

2 免疫组织化学染色技术的实验方法

3 蛋白质免疫印迹技术的实验方法

4 实验结果

5讨论

论文小结

参考文献

致谢