17β-雌二醇分子印迹仿生免疫快速检测方法研究

摘要

目前食品安全问题已逐渐成为社会关注的焦点，其中农药残留、兽药残留、毒素等有毒有害物质的检测方法研究是对食品安全进行监督管理的技术保障。动物饲养过程中，雌激素类物质经常被添加入饲料中，用于提高动物性产品的产量和质量，缩短动物的生长周期，提高生产效率。17β-雌二醇（17β-estradiol,17β-E2）作为环境雌激素中活性最强的物质之一，普遍存在于环境和动物源性食品中，若长期通过食物链在人体中富集，会对人体造成严重危害。
　　目前对雌激素的检测主要采用仪器分析方法和免疫学方法。仪器分析方法需要借助大型的仪器设备，样品前处理过程复杂；免疫学方法需要借助抗体，但抗体的制备和筛选尤为复杂，且易失活。因此建立一种既能实现快速检测，方法简便，又无需借助抗体的检测方法十分重要。分子印迹聚合物（Molecular imprinting polymer, MIP）具有可以特异性识别待测物质的位点，可与待测物质特异性结合，类似于抗原抗体识别反应，称为仿生免疫。并且 MIP具有耐高温、耐强酸碱环境、可长期保存等优点。
　　论文针对17β-E2分子印迹仿生免疫快速检测建立了两种新方法：基于试纸条的分子印迹仿生酶联免疫快速检测方法，以及基于酶标板的分子印迹仿生免疫快速检测方法。这两种方法均可实现对17β-E2的快速检测，与传统方法相比较具有简单快速、价格低廉、容易操作等优点。本论文内容主要包括以下四个部分：
　　第一章主要概述了17β-E2检测方法的研究进展，分子印迹技术的原理、步骤和分类，简单介绍了各类分子印迹制备方法。重点介绍了基于试纸条、酶标板的分子印迹技术研究进展，以及分子印迹技术在环境雌激素检测中应用。
　　第二章建立了一种17β-E2分子印迹仿生酶联免疫试纸条快速检测方法。在试纸条表面制备一层分子印迹聚合物薄膜，聚合物上具有可特异性识别17β-E2的位点。通过17β-E2和酶标记17β-E2对结合位点的竞争结合作用，加入酶的底物显色，根据颜色深浅即可对17β-E2实现定性以及半定量检测。本章内容主要对试纸条类型的选择，合成条件的优化，灵敏度的提高，实验方法性能的考察及基质影响的消除进行了研究。结果表明，MIP合成的最佳聚合反应条件为：12 mL乙腈作为反应溶剂，模板分子17β-E2的添加量为0.1 g，功能单体3-氨基丙基-三乙氧基硅烷（APTES）的添加量为1014μL，交联剂四乙氧基硅烷（TEOS）的添加量为963μL，催化剂（0.1 mol·L-1乙酸）的添加量为100μL。在此最佳条件下合成的MIP具有较强的识别能力，可基本消除非特异性吸附，方法检测限可达到0.25μg·L-1。
　　第三章建立了一种17β-E2分子印迹仿生免疫酶标板快速检测方法。在96孔酶标板表面合成分子印迹聚合物，通过17β-E2和荧光标记的17β-E2对识别位点的竞争结合作用，检测荧光强度，即可对17β-E2实现定量检测。本章内容主要对合成条件的优化，方法性能的考察，及基质影响的消除进行了研究。结果表明， MIP合成的最佳聚合反应条件为：10 mL无水乙醇作为反应溶剂，模板分子17β-E2的添加量为0.1 g，功能单体APTES的添加量为676μL，交联剂TEOS的添加量为642μL，催化剂（0.1 mol·L-1乙酸）的添加量为100μL，在此条件下合成的MIP具有较强的识别能力，可基本消除非特异性吸附。该方法的检测限可达到0.22μg·L-1，灵敏度可达到1.79μg·L-1。
　　第四章对所建立的17β-E2分子印迹仿生酶联免疫试纸条快速检测方法和酶标板快速检测方法进行了总结。这两种方法分别以试纸条和96孔酶标板为载体成功在其表面合成MIP，并在此基础上建立了两种对17β-E2的快速检测方法。与传统检测方法相比较，具有快速、灵敏度高、操作简单、价格低廉、无需借助抗体等优点。

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中英文名词术语对照

第一章 绪 论

1 研究背景

1.1 17β-雌二醇简介

1.2 17β-E2检测方法研究进展

2 分子印迹仿生抗体的制备

2.1 分子印迹技术概述

2.2 分子印迹的基本原理和步骤

2.3 分子印迹技术的分类

2.4 分子印迹聚合物的制备方法

2.5 基于试纸条的分子印迹技术研究进展

2.6 基于酶标板的分子印迹技术研究进展

2.7 分子印迹技术在环境激素检测中的应用

3 论文的选题意义及研究内容

第二章 17β-雌二醇分子印迹仿生酶联免疫试纸条快速检测方法研究

1 研究目的与意义

2 实验材料与仪器

2.1 实验材料与试剂

2.2 实验仪器

2.3 实验相关溶液的配制

3 实验方法与步骤

3.1 酶联17β-雌二醇（17β-E2-HRP）的合成方法

3.2 试纸条上分子印迹聚合物的制备

3.3 分子印迹聚合物模板分子的洗脱

3.4 试纸条非特异性结合位点的封闭方法

3.5 方法灵敏度的考察方法

3.6 方法选择性的考察方法

3.7 方法重现性的考察方法

3.8 方法稳定性的考察方法

3.9 实际样品的预处理方法

4 结果与讨论

4.1 试纸条类型的选择

4.2 非特异性吸附的消除

4.3 方法灵敏度的提高

4.4 方法性能指标的考察

4.5 实际样品基质影响的考察

5 本章小结

第三章 17β-雌二醇分子印迹仿生免疫酶标板快速检测方法研究

1 研究目的与意义

2 实验材料与仪器

2.1 实验材料与试剂

2.2 实验仪器

2.3 实验相关溶液的配制

3 实验方法与步骤

3.1 荧光标记17β-雌二醇（17β-E2-FITC）的制备方法

3.2 17β-E2-FITC的分离纯化

3.3 酶标板上分子印迹聚合物的制备

3.4 分子印迹聚合物模板分子的洗脱

3.5 方法标准曲线的建立

3.6 方法选择性的考察方法

3.7 实际样品的预处理方法

4 结果与讨论

4.1 荧光标记17β-E2的制备

4.2 非特异性吸附的消除

4.3 方法标准曲线的建立

4.4 方法性能指标的考察

4.5 实际样品基质影响的考察

5 本章小结

第四章 结 论

参考文献

致谢

攻读硕士期间科研成果