马尾松花粉多糖的结构分析以及硫酸酯化多糖对肝癌细胞HepG2的影响

摘要

许多研究表明，多糖作为一类重要的生物活性大分子，具有多种功能活性，例如抗氧化，抗肿瘤，降血糖以及提高机体免疫力等。对多糖进行特定的修饰，可以极大提高多糖的生物学活性。本实验室的前期工作已经证明，硫酸化马尾松花粉多糖SPPM60可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖，而未硫酸化的多糖PPM60则对HepG2的增殖无显著性影响。此外，SPPM60可以显著降低HepG2胞内钙离子浓度，而PPM60则对[Ca2+] i无显著性影响。大量实验表明，用适当的方法对多糖进行降解，可以提高多糖的生物活性。目前，鲜有对马尾松花粉多的降解以及降解后多糖构效关系等方面的研究。因此本实验在结合实验室前期工作的基础上，对马尾松花粉多糖组分进行降解，并通过细胞学实验和NMR技术探究降解后多糖与未降解时相比构效关系的不同。
　　本研究主要内容包括：⑴采用水煮醇沉法从破壁马尾松花粉中提取多糖，并采用三氯乙酸法除去杂蛋白，用 TOYOPEARL HW-65S中压凝胶柱层析对80％乙醇沉淀的多糖进行分离纯化，多次重复得到较为均一多糖组分，将其命名为PPM80-B。采用高效凝胶色谱法对多糖组分PPM80-B进行相对分子量的测定，结果测得PPM80-B的相对分子量为317.8K。⑵采用酸解法对松花粉多糖PPM80-B进行降解，得到降解后的低分子量多糖组分，命名为DPPM80-B。在与实验一相同的色谱条件下对DPPM80-B进行相对分子量的测定，测得其分子量为3.131K，表明降解是成功的。采用氯磺酸-吡啶法分别对PPM80-B和DPPM80-B进行硫酸酯化修饰，得到酯化后多糖，并分别命名为SPPM80-B和 DSPPM80-B。采用氯化钡-明胶比浊法分别对SPPM80-B和 DSPPM80-B进行硫酸根取代度的测定，结果测得两者的取代度分别为1.08和1.26。⑶MTT法分别探究四种多糖（PPM80、SPPM80、DPPM80和DSPPM80)对肝癌细胞HepG2增殖的影响。实验结果表明，SPPM80和DSPPM80对 HepG2 的增殖具有抑制作用，且具有时间和剂量依赖性。 SPPM80对HepG2增殖的抑制作用要强于DSPPM80。200昭/m L作用72h SPPM80对HepG2的抑制率达到31.47%，而相同条件下DSPPM80对 HepG2的抑制率则为15.38%。PPM80和DPPM80对HepG2的增殖没有显著地影响。⑷应用fura-2探针采用双波长荧光法测定四种多糖（PPM80、SPPM80、DPPM80和DSPPM80)对肝癌细胞HepG2胞内钙离子浓度的影响。实验结果表明，SPPM80和DSPPM80可以降低HepG2胞内钙离子浓度，且 SPPM80的作用效果更加显著。PPM80和DPPM80对HepG2胞内钙离子浓度没有显著地影响。⑸采用核磁共振波谱法对松花粉多糖的结构进行解析，主要从iHNMR(氢谱）和13CNMR(碳谱）两方面进行考察。结果显示，构成该多糖的单糖以吡喃环的形式存在，且该多糖是一种中性多糖，不含G a lN残基，可能含有乙酰基中甲基氢或氨基糖中于N-乙酰氨基中的甲基氢，有C-6脱氧糖甲基的存在。

目录

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英文缩略词表

第一章 综述

1. 马尾松花粉

2. 糖及其生物学活性

3．多糖的提取、分离与纯化

4．多糖的降解

5. 马尾松花粉多糖相对分子量的测定

6. 硫酸酯化多糖及其生物学活性

7. 硫酸酯化多糖抗肿瘤机制的研究

8. 钙离子通道与肿瘤细胞

9. 核磁共振技术

第二章 马尾松花粉多糖的提取、纯化与相对

1. 材料与试剂

2. 仪器与设备

3 方法步骤

4 实验结果

5. 讨论

第三章 多糖的降解及硫酸酯化

1. 材料与试剂

2. 仪器与设备

3 实验方法步骤

4 实验结果

4 讨论

第四章 马尾松花粉多糖对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

1. 材料与试剂

2. 仪器与设备

3. 实验步骤

4 实验结果

5. 讨论

第五章 马尾松花粉多糖对肝癌细胞HepG2的?Ca2+?i的影响

1. 材料与试剂

2. 实验步骤

3 实验结果

4 讨论

第六章 核磁共振波谱法解析松花粉多糖的结构

1. 材料与试剂

2. 仪器与设备

3. 实验步骤

4. 实验结果

5. 讨论

结论

致谢

参考文献