松花粉多糖硫酸酯化前后对肝癌细胞增殖与细胞周期的影响

摘要

本实验室研究曾表明，马尾松花粉多糖(PPM60)及其硫酸酯化衍生物(SPPM60)均能通过增强免疫抑制小鼠体内S180肉瘤，且SPPM60作用更强。PPM60对体外培养的人白血病K562细胞有较强的抑制作用，而硫酸酯化多糖SPPM60却降低了其抑制作用；PPM60抑制K562细胞的机制可能是升高细胞内钙离子和活性氧浓度，阻滞细胞于G0/G1期，并诱导K562细胞产生凋亡。本实验拟以人肝癌细胞株HepG2为研究对象，考察多糖硫酸酯化前后对人肝癌细胞增殖与细胞周期的影响，并对其体外抗肿瘤的作用机制进行初步探讨，以期为马尾松花粉多糖及其酯化物应用于肿瘤的辅助治疗提供理论依据。实验主要分为以下几个部分。
　　一、马尾松花粉多糖的提取、分离纯化、酯化及鉴定:采用水煮醇沉法对1000g马尾松花粉提取多糖，得到60％乙醇分级沉淀多糖(PPM60)为5.461g。采用Sephacryl S-400HR层析对PPM60分离纯化，得到三种不同分子量的多糖组分，分别命名为PPM60-A、PPM60-B、PPM60-C。采用氯磺酸-吡啶法对PPM60及各纯化组分进行硫酸酯化改性，改性后分别命名为SPPM60、SPPM60-A SPPM60-B、SPPM60-C，用氯化钡-明胶比浊法鉴定其硫酸根含量并计算取代度(DS)分别为1.611、1.4、1.45、0.968。红外光谱显示已具有硫酸酯键(C-O-S和S=O)的特征吸收峰，表明多糖已被硫酸酯化。
　　二、多糖酯化前后对HepG2细胞生长能力的影响:MTT法检测不同浓度SPPM60或 PPM60作用不同时间对人肝癌细胞株 HepG2增殖活力的影响。SPPM60对HepG2细胞的增殖有抑制作用，一定程度上具有剂量和时间依赖性。在200?g/mL和400?g/mL浓度下作用72h，SPPM60对HepG2细胞的抑制率分别为38。21％和39.16％。而PPM60对HepG2细胞没有抑制作用，甚至在某些条件下有轻微的促增殖作用。比较了两种不同取代度的SPPM60(SPPM60-1、SPPM60-2，DS为1.226和1.611):在200?g/mL浓度下作用72h，对HepG2细胞的抑制率分别为40.25％和53.34％，高DS的抑制率与低DS相比，具有显著性差异。
　　三、多糖酯化前后对HepG2细胞周期的影响:流式细胞技术检测SPPM60-2或PPM60处理前后HepG2细胞周期分布的变化。SPPM60-2组较对照组G2/M期细胞比例显著性增加，S期比例均显著性减少，G0/G1期比例没有明显变化，细胞被阻滞在G2/M期。PPM60组细胞周期变化很小。Real-time PCR结果显示，SPPM60-2可以下调CDK1、CyclinB的mRNA表达水平和上调p53和p21的mRNA表达，与对照组相比具有显著性差异，而PPM60处理组各基因的mRNA表达水平，与对照组相比差异不显著。
　　四、多糖酯化前后对HepG2细胞分泌VEGF的影响:SPPM60-2与SPPM60B均能使HepG2细胞培养上清中VEGF的表达有不同程度的下调，分别与对照组和PPM60组相比较，均具有极显著性差异。
　　以上结果表明:(1)PPM60对HepG2细胞的增殖几乎没有什么影响，硫酸酯化以后产生了不同程度的抑制作用，且高取代度的硫酸酯化多糖对HepG2细胞有较高的抑制率。(2)SPPM60-2抑制HepG2细胞增殖的机制是在转录水平上下调CDK1和CyclinB的mRNA表达和上调p53和p21的mRNA表达，使细胞周期阻滞于G2/M期，抑制细胞的分裂。(3)在HepG2细胞中，SPPM60-2具有一定的抗血管生成作用，而酯化前组分则作用不明显。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 综 述

1.多糖

2.多糖的分子修饰

3.硫酸化多糖抗肿瘤作用的机制

第二章 马尾松花粉多糖的提取、分离纯化、酯化及鉴定

2 仪器与设备

3 方法步骤

4 实验结果

5 讨论

第三章 多糖酯化前后对HepG2细胞生长能力的影响

1 材料与试剂

2 仪器与设备

3 方法步骤

4 实验结果

5 讨论

第四章 多糖酯化前后对HepG2细胞周期的影响

1 材料与试剂

2 仪器与设备

3 方法步骤

4 实验结果

5 讨论

第五章 多糖酯化前后对VEGF的影响

1 材料与试剂

2 仪器与设备

3 方法步骤

4实验结果

5 讨论

总 结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章