松花粉多糖的制备方法、松花粉多糖及其在药物中的应用

摘要

本发明公开了一种松花粉多糖的制备方法，该方法依次包括如下过程：(1)提取：将破壁的松花粉用水煎煮提取，过滤；(2)除杂：经胰酶和纤维素酶酶解，高速离心和超滤除杂；(3)醇沉：未滤过液用乙醇醇沉，沉淀干燥，得松花粉粗多糖；(4)洗脱：将松花粉粗多糖在DEAE一纤维素柱子上洗脱。(5)干燥：洗脱液纳滤，未滤过液浓缩至干，干燥，经粉碎得松花粉单一多糖。还公开了一种松花粉多糖，以及其在制备降低血脂、血压、血糖和抗疲劳、提高免疫力的药物作用。为松花粉的开发和利用提供了一种新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及松花粉多糖及其制备方法，以及其在制药中的应用，尤其是松花粉多糖在制备降血脂、降血压、降血糖、抗疲劳和提高免疫力的药物中的应用。

背景技术

随着我国经济社会的快速发展，人民生活水平的不断提高，随之而来的是人们饮食习惯的改变，不良嗜好的增多，工作节奏的加快及社会压力的加重等。这些因素导致人们身体上普遍存在着亚健康状态的问题，比如过于疲劳、衰老加快、免疫力下降、高血压、高血脂、高血糖等。这很容易诱发象脑血栓、脑出血、冠心病、糖尿病等难彻底治愈和突发性危害很大的疾病。随着这类心脑血管疾病的患病率越来越高及患病年龄趋于年轻化，这已经对人类的健康造成极大的威胁，也加大了社会的负担。

松花粉，早在二千多年前的《神农本草经》就有记载，其名为“松黄”，另外在《本草纲目》中描述其功用为：“松花别名松黄，甘，温，无毒润心肺，益气，祛风止血，亦可酿酒”，是保健的珍品，古时就曾为宫廷的贡品。

本发明人通过对松花粉多糖的提取方法进行了反复的研究与试验，提纯得到松花粉多糖物含量极高的提取物，并经过反复摸索和长期实验结果表明，松花粉多糖具有调节血脂、血压、血糖功效，同时还具有抗疲劳，提高免疫力的功能。这些松花粉多糖的相关功效均未见报导过。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种松花粉多糖的制备方法。

本发明的第二个目的还在于是提供一种松花粉多糖。

本发明的目的之三在于提供一种松花粉多糖新的用途。

为实现本发明的第一个发明目的，本发明采用如下技术解决方案，一种松花粉多糖的制备方法，该方法包括如下过程：

(1)、提取：将破壁的松花粉用水煎煮提取，过滤；

(2)、除杂：经胰酶和纤维素酶酶解，高速离心和超滤除杂；

(3)、醇沉：未滤过液用乙醇醇沉，沉淀干燥，得松花粉粗多糖；

(4)、洗脱：将松花粉粗多糖在DEAE-纤维素柱子上洗脱；

(5)、干燥：洗脱液纳滤，未滤过液浓缩至干，干燥，经粉碎得松花粉单一多糖。

所述的提取过程可以为：取破壁松花粉，加入25～30倍量的水，于加热提取罐中，搅拌加热升温至90℃～105℃，恒温搅拌提取8～12h，然后降温至40～48℃，过滤。

所述的除杂过程可以为：滤液用碱调节pH至6.5～8.5，加入松花粉重量1％～5％的胰酶，40～48℃保温酶解4～8小时，加热升温至95～105℃，至少维持15分钟，然后降至室温，用酸调节pH4.5～6.0，加入松花粉重量1％～5％纤维素酶，在40～48℃保温酶解4～8小时，再加热升温至95～105℃，至少维持15分钟，降至室温；然后用9000～30000g的相对离心力高速离心，收集上清液，用截流分子量为10～100kd的超滤膜超滤，收集未滤过液。

所述的醇沉过程可以为：未滤过液浓缩至相对密度为1.05～1.2，用乙醇调至浓度为65％～80％的乙醇溶液，4℃醇沉12～18h，离心，收集沉淀，经乙醇洗涤后，减压真空干燥，得松花粉粗多糖。

所述洗脱过程可以为：将松花粉粗多糖溶于水，并注入到DEAE-纤维素中，先用水洗去杂质，然后用0.5～1mol/LNaOH溶液洗脱，收集NaOH洗脱液，用酸调节pH至6.0～7.5。

松花粉多糖提取物的干燥方法为真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、微波干燥等，最好为真空干燥或冷冻干燥。

本发明还提供了一种松花粉多糖，是采用上述方法用破壁松花粉经过水提、除杂、醇沉、洗脱、干燥得到的产物。

本发明还提供了松花粉多糖的新用途。

一种松花粉多糖在松花粉多糖在制备降低血糖的药物中的应用。

一种松花粉多糖在制备降低血脂的药物中的应用。

一种松花粉多糖在制备降低血压的药物中的应用。

一种松花粉多糖在制备抗疲劳的药物中的应用。

一种松花粉多糖在制备提高免疫力的药物中的应用。

松花粉多糖，经本发明人反复研究及实验证实，其对高血糖或高血压或高血脂的实验动物具有很好的降低血糖和血压、血脂作用。同时，动物实验还表明，松花粉多糖具有抗疲劳和提高免疫水平的作用。能够用作治疗上述疾病的药物，或作为药物的有效成份之一。本发明的松花粉糖提取物的提取方法，其松药粉多糖的含量采用苯酚硫酸法测定可达90％以上，是高纯度的单一的松花粉多糖，改变了松花粉开发、利用方式，具有很高的经济和社会效益。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，并不以此限定本发明的范围。

实施例1：松花粉多糖的制备

(1)、提取：取破壁松花粉2kg，加入60L水，于加热提取罐中，搅拌加热升温至95℃～100℃，恒温搅拌提取8h，降至40～45℃。

(2)、除杂：用NaOH调节pH至8.0～8.5，加入松花粉重量3％的胰酶，40～45℃保温酶解4小时，然后加热升温至95℃，维持15min，再降至室温；用HCl调节pH5.5～6.0，加入松花粉重量3％的纤维素酶，40～45℃保温酶解4小时，加热升温至95℃，维持15min，降至室温。用9100g的相对离心力高速离心，收集上清液，用截流分子量为100kd的超滤膜超滤，收集未滤过液。

(3)醇沉：未滤过液加热浓缩至相对密度为1.1，用乙醇调至浓度为75％的乙醇溶液，4℃醇沉16h，离心，收集沉淀，经乙醇洗涤后，60℃减压真空干燥，得松花粉粗多糖。

(4)洗脱：将松花粉粗多糖溶于水，并注入到DEAE-纤维素中，先用水洗去杂质，然后用1mol/L NaOH溶液洗脱，收集NaOH洗脱液，用HCl溶液调节pH至6.5～7.0

(5)干燥：纳滤，未滤过液浓缩至干，冷冻干燥，经粉碎得单一组分松花粉多糖，其含量为91.2％。

实施例2：松花粉多糖对肾性高血压大鼠血压水平的影响

1、实验动物与组别设置

Wistar大鼠，9～10周龄，体重200±20g，雄性，随机分成空白对照组，以及模型对照组与实验药物I组、II组，每组10只。

2、高血压大鼠模型制备

用地西泮5mg/kg和氯胺酮50mg/kg，皮内麻醉大鼠，仰卧位固定，皮肤消毒后于剑突下1.5cm，沿腹中线切开皮肤及肌层，轻轻挤出肾脏，用浸有生理盐水棉花包住，然后用左手食指与拇指将其固定。右手用无钩直头眼科镊小心分离肾蒂部筋膜，沿肾静脉下方分离肾动脉，在近主动脉端用H形银夹(内径为0.20～0.25mm)套上，将对侧肾切除，最后分层缝合手术切口。4～5周后选取收缩压＞160.15mmHg者作为肾血管性高血压大鼠。

3、实验方法

(1)、松花粉多糖的正常大鼠试验

将正常大鼠随机分为3组，每组10只，实验药物I组、II组分别灌服松花粉多糖(按实施例1中方法制备)100mg/kg和300mg/kg，灌胃量均为10ml/kg，空白对照组灌服等量生理盐水，连续给药15d，实验期间动物饮水及摄食随意。测压前将大鼠放入37±1℃电热恒温箱内加温，15min后，用大鼠血压测定仪测定大鼠尾动脉收缩压，实验开始及结束时各进行一次，连续测3次取平均值作为测定值。

(2)、松花粉多糖对高血压模型大鼠的作用

将正常大鼠随机分为4组，每组10只，其中实验药物I组、II组与模型对照组制作高血压模型，实验药物I组、II组给药同上，空白对照组与模型对照组灌服等量生理盐水，连续给药15d，实验期间动物饮水及摄食随意。测压前将大鼠放入37±1℃电热恒温箱内加温，15min后，用大鼠血压测定仪测定大鼠尾动脉收缩压，实验开始及结束时各进行一次，连续测3次取平均值作为测定值。

4、结果与分析

4.1对正常大鼠血压的影响

实验药物I、II组的血压与空白对照组的比较，下降明显(P＜0.05及P＜0.01)，说明松花粉多糖对正常动物的血压有降低作用，见表1。

                表1  松花粉多糖对正常大鼠血压的影响

  组别  n                 血压(mmHg)  给药前  给药后  空白对照组  10  131.14±16.34  132.02±15.75  实验药物I组  10  132.79±15.30  122.15±15.20^#  实验药物II  组  10  132.57±16.12  110.75±16.11^*

与空白对照组比较，#P＜0.05，*P＜0.01

4.2对高血压大鼠模型的影响

给药前造模的组与空白对照组比较，P＜0.01说明高血压大鼠模型制造成功；实验药物I组、II组给药前后组间比较P分别小于0.05和0.01，说明松花粉多糖有明显的降低高血压模型大鼠血压的作用。见表2

        表2  松花粉多糖对高血压大鼠模型血压的影响

  组别  n                  血压(mmHg)  给药前  给药后  空白对照组  10  105.30±16.73  107.22±15.16  模型对照组  10  159.28±24.61^##  161.37±11.39  实验药物I  组  10  157.69±15.65^##  146.84±13.72^*  实验药物II  组  10  160.88±18.15^##  141.83±12.53^**

给药前后组内比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较##P＜0.01；

实施例3：松花粉多糖对血脂失调症大鼠血脂水平的影响

1.动物选择与组别设置

同实施例2。

2.大鼠高脂血症模型制备

大鼠高脂血症模型采用高脂饲料致高脂血症法。高脂饲料配方如下：基础饲料86.3％、胆固醇3％、猪油10％、甲基硫氧嘧啶0.2％、猪胆盐0.5％，保证各成分混合均匀。连续灌服2周，戊巴比妥钠溶液麻醉，取尾血，检测血脂，证明模型制造成功。

3.实验方法

空白对照组：不造模，不给药，给予等量生理盐水；

模型对照组：造模，不给药，每天早上给予高脂饲料；

实验药物I组、II组：造模，早上给予高脂饲料，下午分别灌服以实施例1中方法制备的松花粉多糖100mg/kg和300mg/kg，灌胃量均为10ml/kg，连续14天。停药24小时(禁食16小时)，戊巴比妥钠溶液麻醉，取尾血，检测。

4.检测指标

血清化学指标包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-L)。试剂采用日本罗氏试剂公司产品，用日立7020自动生化分析仪测定。

5.统计分析采用多因素方差分析法

6.结果与分析

模型对照组与空白对照组比较其血清学指标均具有显著差异，P＜0.001。在给药14天后，实验药物I组、II组与模型对照组比较，血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平均显著降低，高密度脂蛋白胆固醇水平有所回升，P均小于0.001，这表明松花粉多糖对血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平均有显著降低作用，同时能提高高密度脂蛋白胆固醇水平，见表3。

          表3  松花粉多糖对模型大鼠血脂的影响

  组别  TC(mmol/L)  TG(mmol/L)  LDL-C  (mmol/L)  HDL-L  (mmol/L)

  空白对照  组  4.35±0.86  0.61±0.13  2.83±0.34  0.96±0.18  模型对照  组  13.85±2.06^#    1.63±0.34^#  9.72±1.18^#  0.42±0.13^#  实验药物  I组  6.89±1.60^*  0.61±0.18^*  3.31±0.50^*  0.98±0.35^*  实验药物  II组  6.52±1.72^*  0.57±0.12^*  3.31±0.50^*  1.22±0.20^*

注：与空白对照组比较，#P＜0.001，与模型对照组比较*P＜0.001

实施例4、松花粉多糖对四氧嘧啶模型大鼠血糖水平的影响

1、实验动物选择与组别设置

昆明种小鼠，6周龄，体重20±2.0g，随机分成空白对照组、模型对照组、实验药物I组和实验药物II组，每组10只，雌雄各半。

2、四氧嘧啶模小鼠模型的制作

小鼠禁食12小时后，用即配制的10mg/ml四氧嘧啶溶液，按120mg/kg给小鼠腹腔注射，诱发糖尿病动物模型。造模当晚及第二天注意观察小鼠状态，急救因血糖过低明显发生痉挛的小鼠，即以饱和葡萄糖溶液灌胃0.2ml/只。

3、实验方法

(1)、实验前各组小鼠按下述方法测空腹血糖值。

(2)、测定之后，除空白对照组外，其余各组按上述方法制造四氧嘧啶小鼠模型，再接着测定模型的空腹血糖值，如果浓度大于11mmol/L则可确定模型制造成功。第二天开始给药，实验药物I组、II组分别灌服松花粉多糖100mg/kg和300mg/kg，灌胃量均为20ml/kg；空白对照组与模型对照组不给予药物，灌服等量生理盐水，连续15天，取血测定血清中葡萄糖含量。

4、检测方法

(1)、小鼠眼内眦取血，4℃静置一个小时，然后4℃、3000rpm离心10分钟，分离上层血清，用葡萄糖氧化酶法测定血清中葡萄糖含量。试剂采用上海荣盛生物技术有限公司生产的葡萄糖试剂盒，仪器用日立7020自动生化分析仪。

(2)、统计分析采用t检验。

4、结果与分析

各实验组间实验前空腹血糖测定值以及制造模型的各组间的血糖测定值，P＞0.05，无显著差异，具有可比性；实验药物I、II组的给药前后组内比较其P值均小于0.01，具有显著差异，说明松花粉多糖具有降低血糖的作用，结果见表4。

             表4  松花粉多糖对四氧嘧啶模型小鼠血糖水平的影响

  组别                血糖浓度(mmol/L)  P  空腹血糖  给药前  给药后  空白对照组  4.38±0.96  4.80±1.12  4.16±0.75  ＞0.05  模型对照组  4.63±0.85  12.29±1.19  11.93±1.18  ＞0.05  实验药物I  4.53±0.95  12.45±1.47  10.13±1.13  ＜0.01

  组  实验药物II  组  4.69±1.52  11.33±1.19  8.64±1.32  ＜0.01

实施例5、小鼠负重游泳试验

1、实验方法

昆明种小鼠，6周龄，体重20±2g，随机分成空白对照组、实验药物I组和实验药物II组，每组10只，雌雄各半。实验药物I组和实验药物II组分别按每天每只100mg/kg和300mg/kg分别灌服松花粉多糖，空白对照组给予等量双蒸水，灌胃量均为20ml/kg，连续15天。最后一次给药1h后，每只鼠尾部负重(8％体重)，放入水温22℃，80×60×40cm水槽中，记录小鼠游泳时间。

2、结果与分析

实验药物I组和II组均能明显延长小鼠游泳时间(见下表)，表明松花粉多糖能明显增强小鼠抗疲劳的能力，结果见表5。

表5  松花粉多糖对小鼠负重游泳时间的影响

  组别  游泳时间(min)  空白对照组  20.35±11.27  实验药物I组  30.86±10.36^#  实验药物II组  41.21±14.11^*

与空白对照组比较，#P＜0.05，*P＜0.01；

实施例6、松花粉多糖对小鼠免疫器官重量及网状内皮系统吞噬功能的影响

1、松花粉多糖对小鼠免疫器官重量的影响

取BALB/c小鼠30只，体重20±2g，分组及给药同实施例5，每日1次，连续7d。最后1次给药30min后，断颈处死，摘取胸腺和脾脏，称重，计算胸腺指数和脾脏指数，结果见表6。

      表6  松花粉多糖对小鼠免疫器官重量的影响

  组别  胸腺指数(mg/10g)  脾脏指数(mg/10g)  空白对照组  26.54±6.34  39.20±10.83  实验药物I  组  32.91±5.77#  46.37±7.70#  实验药物II  组  40.64±7.62*  53.64±9.78*

注：与空白对照组比较，#P＜0.05，与模型对照组比较*P＜0.01

2.4松花粉多糖对小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响

取BALB/c小鼠30只，体重20±2g，分组及给药同实施例5，每日1次，连续7d。最后1次给药30min后，尾静脉注射印度墨汁(用生理盐水稀释5倍)0.1ml/10g体重，于注射2、12min时分别于小鼠眼眶静脉丛取血25ul，置于2ml0.1％Na₂CO₃溶液试管中，摇匀，以0.1％Na₂CO₃为空白，用分光光度计在600nm处比色，测定光密度(OD)，计算廓清指数k。结果表明松花粉多糖I组、II组对正常小鼠网状内皮系统吞噬功能有明显增强作用，与空白组比较P值分别小于0.05和0.01，具有显著统计学意义，结果见表7。

表7  松花粉多糖对小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响

  组别  吞噬指数  空白对照组  0.0039±0.0020  实验药物I组  0.0068±0.0024^#  实验药物II组  0.0084±0.0021^*

注：与空白对照组比较，#P＜0.05，与模型对照组比较*P＜0.01。