细胞内尿嘧啶-DNA糖基化酶的超灵敏检测研究

摘要

DNA碱基结构特性可能被多种因素破坏，如果不及时修复，将会导致机体基因组的不稳定性而诱发癌变。对此，生物机体有相应的修复措施，如碱基切除修复路径（BER），这是一种高度保守的DNA切割活动，该路径由DNA糖基化酶来启动。尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是负责修复由尿嘧啶诱导的DNA损伤和维持基因组完整性的重要碱基切除修复酶，并且，UDG的异常表达与各种癌症有关。因此，精准检测UD G活性对于生物医学研究和临床诊断至关重要。目前，核酸的等温扩增技术在成为了一种有前途的超灵敏检测方法，该方法操作简便，可应用于超灵敏检测多种目标物，如蛋白质，细胞，小分子和离子。 在这里，我们开发了一种超灵敏检测UDG活性的荧光方法，该方法包括（1） UDG 驱动尿嘧啶切除修复，（2）切口酶介导的恒温指数扩增，（3）核糖核酸酶H（RNase H）诱导水解信号探针，产生荧光信号。UDG的存在使得能够从U-A碱基对中的U被去除，并产生无嘌呤/无嘧啶（AP）位点。核酸内切酶IV（Endo IV）随后裂解 AP位点，破坏DNA底物。被切割的DNA底物同时起到了引物和模板的作用，启动了恒温指数扩增，产生大量的触发器。所产生的触发器可以选择性地与信号探针杂交，形成RNA-DNA异质双链体，随后加入的RNase H可以水解RNA-DNA异质双链体中的RNA，产生荧光信号。该检测方法具有超高的灵敏度，可以测量单个细胞水平上的UDG活性。此外，该方法还可应用于酶活动力学参数的测定和抑制剂的筛选，这为DNA修复酶的相关生物医学研究和临床诊断提供了强有力的工具。

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