猪圆环病毒2型抗原和抗体胶体金检测方法的建立

摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus2，PCV2）是导致断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）病发的主要病原体，给我国的养猪企业造成不可估计的经济损失。伴随着科技的发展，PCV2抗原的检测方法主要包括电镜检测、原位杂交技术（ISH）、免疫组化试验（IHC）、环介导恒温扩增技术（LAMP）及聚合酶链反应技术（PCR）。PCV2抗体的检测方法主要包括间接免疫荧光技术（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）及胶体金免疫层析法（GICA）。除GICA外，其余的检测方法均需要专业人员进行实验操作，对实验仪器要求较高且仅限于实验室内操作。GICA不仅具有操作简便、快速显示检测结果的突出优点，而且不需要专业人员进行操作，对检测场地也没有限制要求，适用于大量临床样品的定性检测。 本研究对PCV2抗原胶体金检测试纸条的研制进行了条件摸索，初步确定了显色较好的试纸条配对方案，为快速鉴别PCV2打下良好的基础。与此同时，成功研制出PCV2抗体胶体金检测试纸条，该检测试剂条特异性好、敏感性高、批内批间可重复性较高，稳定性好，与ELISA试剂盒的符合率较高，并进行了临床应用，为PCV2抗体的临床诊断提供了快速有效的试剂盒。 1.PCV2单克隆抗体的纯化及鉴定 通过饱和硫酸铵沉淀法对本实验室制备的5种含有单克隆抗体（2C3、3D4、1G4、2G4、6H12）的小鼠腹水进行纯化，以PCV2蛋白为样本，将纯化后的单抗做一抗，经Western-blot鉴定，表明这5种单抗均与PCV2蛋白发生特异性反应，为后期PCV2抗原检测试纸条的制备奠定基础。 2.PCV2抗原检测免疫层析试纸条的研制 将不同体积的K2CO3加入到固定体积的胶体金溶液内，形成不同的pH。然后再将5种不同浓度的单克隆抗体喷涂于金标垫上作为金标单抗，分别将5种单抗包被在NC膜的T线，将羊抗鼠IgG包被在NC膜的C线，经排列组合后组装成多种检测试纸。分别滴加PCV2细胞毒和生理盐水进行检测并记录显色情况。试验结果显示，滴加PCV2细胞毒后，部分试纸条会出现正常的显色结果，但稳定性和重复性较差，所以，在今后的实验中会继续优化实验方案，使得抗原检测试纸条的研制方法更加成熟，顺利完成PCV2抗原胶体金检测方法的建立。 3.PCV2Cap蛋白的原核表达与鉴定 将ORF2基因的密码子修改成大肠杆菌嗜好的密码子，但优化后氨基酸的序列不变，并将优化后的ORF2基因采用人工合成的方法合成全部基因序列，与pET30a载体连接后，构建重组的表达载体pET30a-ORF2，经PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后，均显示载体构建正确，将其命名为pET30a-ORF2原核表达载体。 将重组质粒pET30a-ORF2转化至大肠杆菌BL21内，对菌体的诱导表达条件进行优化，经SDS-PAGE电泳分析，结果表明目的条带为37kD，与预期分子量大小一致且实现了目的蛋白的最大表达量。经Western-Blot鉴定，该目的蛋白可以与PCV2抗体阳性血清发生反应，表明菌体表达的Cap蛋白具备免疫学活性。最后，将菌体超声裂解，收集上清液并通过Ni-NTA亲和层析柱完成蛋白纯化，收集的可溶性Cap蛋白的纯度最高可达100%，为后期PCV2抗体检测试纸条的研制奠定基础。 4.PCV2抗体检测免疫层析试纸的研制及应用 通过胶体金对纯化后的Cap蛋白进行标记，并将其固定在金标垫上。将Cap蛋白和羊抗鼠IgG分别包被在NC膜的T线和C线，制备出PCV2抗体快速检测试纸条，成功建立了PCV2抗体快速检测方法。通过滴加PCV2阳性血清、PCV2阴性血清、PRRSV阳性血清、CSFV阳性血清及PRV阳性血清综合评价试纸条的特异性、敏感性、重复性和稳定性四个方面的指标。与此同时，完成试纸条与ELISA试剂盒的比对试验。结果表明，该试纸特异性良好，与PRRSV、CSFV及PRV阳性血清不发生反应；敏感性与重复性均良好；与ELISA试剂盒（瑞普）的符合率高达95.00%。综上所述，本试验研制的PCV2抗体检测试纸条具有操作简便，快速显示检测结果的优点，同时不需要专业人员进行操作，对使用环境没有限制，适用于对大量临床样品的定性检测，进一步表明本实验室已建立成熟的PCV2抗体快速检测方法。

目录

声明

符号说明

第一部分 文献综述

1 猪圆环病毒概述

1.1 病毒的发现与分类

1.2 病毒的基因组结构

1.3 编码蛋白

1.4 PCV2的流行病学

1.5 PCV2疫苗研制

2.1 电镜检测

2.2 原位杂交技术（ISH）

2.3 免疫组化试验（IHC）

2.4 环介导恒温扩增技术（LAMP）

2.5 聚合酶链反应技术（PCR）

3.1 间接免疫荧光技术（IFA）

3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

3.3 免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）

3.4 胶体金免疫层析法（GICA）

第二部分 实验研究

试验一 PCV2单克隆抗体的纯化与鉴定

试验二 PCV2抗原检测免疫层析试纸的制备及评价

试验一PCV2 Cap蛋白的原核表达与鉴定

试验二 PCV2抗体检测免疫层析试纸的研制及应用

结论

参考文献

致谢

硕士期间发表的学术论著

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