猪圆环病毒2型糖基化位点突变对病毒复制能力和致病性的影响及抗体胶体金检测方法的建立

摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸道病复合征（PRDC）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪增生性和坏死性肺炎（PNP）、猪的流产和死亡综合征（SAMS）和猪先天性脑震颤（CT）等严重危害我国乃至世界养猪业的疫病的主要原因，感染后能引起感染母猪繁殖障碍以及免疫抑制，造成极大的经济损失。
　　世界各地分离的PCV2毒株被分成不同的亚型而且毒株也在不断发生变异。从2005年到2013年课题组共从山东省分离到32株PCV2毒株。对这32株病毒全基因组进行了测序并递交GenBank。同源性分析发现32株PCV2 ORF1基因编码蛋白质同源性为98.4-100％，而且三个糖基化位点23-25aa（NPS）、256-258aa（NQT）及286-288aa（NAT）没有发生变异。ORF2基因编码蛋白质同源性为88-100%，其糖基化位点143-145aa（NYS）同样没有发生变异。遗传演化分析显示PCV2b/1C亚型是目前山东省主要流行亚型，可能是由于选择的压力，此亚型已与目前使用的PCV2疫苗亚型明显不同。
　　感染性克隆是研究病毒基因组结构与功能以及病毒宿主相互作用的重要手段，是纯化病毒以进行致病性研究和疫苗生产最好的方法。为了获得PCV2的感染性克隆，本研究通过对构建PCV2的感染性克隆方法进行比较获得了较好的拯救病毒的方法。本研究共构建四种PCV2感染性克隆并转染PK-15细胞。应用IFA和Real-time PCR方法检测拯救病毒。结果显示四种方法构建的感染性克隆都能够用IFA检测到拯救病毒。但是Real-time PCR结果显示环化DNA转染的方法能够检测到最多的PCV2 DNA拷贝，pEASY-PCV2方法拷贝数最少，pSK-2PCV2和pSK-PCV2两种方法检测到相似的DNA拷贝数。本研究为PCV2感染性克隆的构建和拯救打下了良好的基础。
　　为研究PCV2 Cap蛋白糖基化位点对病毒复制以及致病性的影响，以实验室前期构建的含有PCV2全基因组的重组质粒pEASY-Blunt-PCV2为最初模板。利用重叠PCR和感染性克隆构建方法，设计1对引物，对PCV2 Cap蛋白上N-糖基化位点143aa-145aa（NYS）进行突变（将N突变为D），构建含突变位点感染性克隆并成功拯救病毒。结果显示糖基化位点突变对病毒的复制能力与未突变病毒差异不显著（P>0.05）。对拯救病毒传代后，人工感染6周龄BALB/c雌性小鼠。结果显示含有突变位点拯救病毒攻毒后影响攻毒小鼠的体重增长，并能在血液中检测到PCV2特异性抗体，在攻毒小鼠各个脏器中都能检测到病毒，病理检测结果显示PCV2对各个脏器都造成不同程度的损伤，并且在抗体水平、损伤程度等方面与不含突变位点感染性克隆攻毒组差异不显著（P>0.05），但与细胞液攻毒对照组相比差异极显著（P<0.01）。
　　PCV2引起的系列疾病频繁爆发给各地养猪业疫病防控带来巨大的难题。为了实现对PCV2的快速诊断，课题组采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，并将其标记SPA，将金标SPA包被至玻璃纤维膜上制备金标垫，将纯化的Cap蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上，建立了一种检测猪圆环病毒2型抗体的胶体金免疫层析方法，并组装试纸条。检测结果显示，组装的检测卡只与猪圆环病毒阳性血清发生特异性反应，检测的灵敏度可以稀释到100倍。用此检测卡与商品化ELISA试剂盒对86份临床血清进行对比检测，两者的阳性率分别为65.12%和70.93%，符合率为94.2%。该方法检测速度快，15min内可出结果，特异性强，操作简便，可广泛应用于基层。

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英文缩写符号及中英对照表

第一部分 文献综述

一、猪圆环病毒研究进展

二 、糖基化修饰作用

实验一：32株PCV2山东分离株遗传演化分析

摘要

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

实验二： PCV2感染性克隆拯救方法的比较

摘要

1 材料与方法

2 结果与分析

3.讨论

实验三：含PCV2 Cap蛋白糖基化位点突变体感染性克隆的构建及拯救

摘要

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

实验四：含PCV2 Cap蛋白糖基化位点突变体感染性克隆的致病力分析

摘要

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

实验五：SPA胶体金免疫层析方法检测PCV2抗体的初步建立及应用

摘要

1 材料与方法

2 结果与分析

3.讨论

结论

参考文献

致谢

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