湿地植物内生菌Klebsiella aerogenes S27降解孔雀石绿的功能和机制研究

摘要

孔雀石绿（Malachite Green,MG）是一种三苯甲烷类工业染料，具有稳定的分子结构。因为其具备使用成本低和防治鱼类等水产品的烂鳃病等效果好的特征，在食品产业、纺织印染产业及水产品养殖过程中曾被广泛的应用。近年来，研究表明孔雀石绿对人和动物具有很强的生物毒性，能够在自然界尤其水环境中富集，且能够在鱼类等生物体内富集，从而造成了严重的环境污染问题。目前物理、化学、生物等手段已在孔雀石绿的修复治理过程中得到了应用，其中生物修复手段由于具备环境友好且环境适应性强的特点而受到研究者们的关注。研究表明，植物-微生物联用机制的生物修复手段能够有效降解土壤或水质的小分子污染。某些植物内生菌具备可代谢降解有机污染物并促进植物生长的作用，能够通过与植物宿主的相互作用修复污染环境。 本研究首次从湿地植物——盐地碱蓬（Suaeda salsa）的叶部中分离出了一株能够降解孔雀石绿的植物内生细菌，鉴定并命名为Klebsiella aerogenes S27。本论文以菌株K.aerogenes S27为研究对象，详细研究该菌株对孔雀石绿的脱色特性和脱色机理。在该菌中发现一类新型三苯甲烷还原酶KaTMR，在孔雀石绿的降解过程中发挥了重要作用，并对该酶进行了重组表达和性质研究。最终揭示了菌株K.aerogenes S27降解孔雀石绿的分子机制。同时，通过毒理学研究，讨论了菌株Klebsiella aerogenes S27和三苯甲烷还原酶KaTMR的实际应用潜能。为植物-内生菌联合修复孔雀石绿的生物过程研究奠定了基础。本论文的主要研究内容如下： （1）植物内生菌K.aerogenes S27降解孔雀石绿的性质和潜在机制研究：从黄河三角洲湿地采集了典型盐生植物盐地碱蓬，从中分离出了1株能够降解孔雀石绿的降解菌。通过平板观察、设计生化实验鉴定和16s rRNA比对序列分析，鉴定其属于Klebsiella aerogenes种属。实验室将该菌株命名为Klebsiella aerogenesS27（菌株保藏号：M201745）。菌株S27在30℃和pH=7.0培养条件下，8h内能够完成对MG（(100mg l-1)）的完全脱色。通过紫外光谱（UV-Vis）和傅里叶红外光谱（FT-IR）分析代谢产物表明菌株S27能够对MG的进行降解。菌株S27分别在NaCl0-9%（w/v）、pH7-10和温度25-41℃条件下仍能够对MG(100mg l-1)的降解率高达90%以上。分析该菌与孔雀石绿降解相关的酶活性表明，菌株S27中的三苯甲烷还原酶与孔雀石绿降解有关。 （2）新型三苯甲烷还原酶KaTMR降解孔雀石绿的酶学性质研究：根据已有文献报道过的三苯甲烷还原酶的基因序列设计引物，在菌株S27中扩增得到一个新型三苯甲烷还原酶。其碱基对数为849bp。基因共编码有282个氨基酸，预测分子量大小为31.02kDa。与已报到过的三苯甲烷还原酶TMRs相比，该酶在氨基酸序列中与它们仅显示出42.6-43.3%的同一性，并且它在系统发育上形成了TMRs家族中的新分支。因此，实验室将该新型三苯甲烷还原酶命名为KaTMR（AccessionNo.MH377117）。将该编码基因克隆至表达载体pET-22b（+），并转化入大肠杆菌BL21中进行异源表达，获得有活性的目的蛋白。酶动力学分析表明，该重组酶降解孔雀石绿小分子的Km、Vmax值和kcat/Km值分别为68.89μmoll-1、10.76μmoll-1min-1和1.23s?1μmol?1，具有较高的亲和能力和降解活性。 （3）植物内生菌K.aerogenes S27及其三苯甲烷还原酶KaTMR降解孔雀石绿的化学机制研究和产物毒性分析：通过液相质谱（LC-MS）分析菌株S27和重组KaTMR降解MG的产物。结果表明，菌株S27的MG降解产物主要包括N，N-二甲基苯胺（m/z121）和去甲基隐性孔雀石绿（m/z315）；重组KaTMR降解MG的产物分别为N，N-二甲基苯胺（m/z121），（4-二甲基氨基-苯基）-苯基-甲酮（m/z225），隐性孔雀石绿（m/z330，LMG）和去甲基孔雀石绿（m/z315）。上述结果与已报道过微生物降解孔雀石绿的产物存在差异。由此，本研究提出了一条MG生物降解的新型途径。同时毒性试验是表明与MG溶液相比，经菌株S27和酶KaTMR降解后代谢物的毒性显著降低。 综上，本课题首次发现了内生菌降解孔雀石绿的功能，并证明K.aerogenes种属细菌具有降解孔雀石绿的功能。对K.aerogenes S27降解孔雀石绿的性质和分子机制进行了研究。并首次揭示了一类新型三苯甲烷还原酶KaTMR降解孔雀石绿的分子机制。该研究所取得结果扩展了具有生物降解活性的微生物资源和酶资源，有助于开发新型功能酶，并能够为植物-内生菌在生物修复过程中的研究提供重要数据。

目录

声明

缩略词

第一章 文献综述

1.1 植物内生菌

1.1.1 植物内生菌的概念

1.1.2 植物内生菌的研究进展

1.2.1 三苯甲烷类染料

1.2.2. 孔雀石绿概述

1.3.1 紫外分光光度法

1.3.2 高效液相色谱法（HPLC）

1.3.3液相色谱-质谱联用法（LC-MS）

1.3.4 气相色谱-质谱法（GC-MS）

1.4 降解三苯甲烷类染料及孔雀石绿的研究进展

1.4.1 物理方法

1.4.2 化学方法

1.4.3 生物方法

1.4.4 微生物对孔雀石绿的脱色机理

1.5 微生物降解孔雀石绿的相关基因研究

1.6 微生物降解孔雀石绿的前景与展望

1.7.1本论文的立题依据

1.7.2本论文的研究内容

1.7.3 本论文的技术路线

第二章 具有孔雀石绿降解活性的湿地植物内生菌Klebsiella aerogenes S27的分离与鉴定

2.1 引言

2.2.1 植物材料

2.2.2 主要试剂和培养基

2.2.3 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 盐地碱蓬的采集

2.3.2 碱蓬中孔雀石绿降解活性菌株的分离与纯化

2.3.3 孔雀石绿降解活性菌株的16S rRNA的测定和降解菌株系统发育地位的确定

2.3.4 孔雀石绿含量的测定

2.4 实验结果与分析

2.4.1 碱蓬内生菌的分离结果

2.4.2孔雀石绿降解活性菌株系统发育地位的确定

2.5 讨论

第三章植物内生菌Klebsiella aerogenesS27降解孔雀石绿的性质研究

3.1引言

3.2.1 实验材料

3.2.2 主要仪器和试剂

3.3 实验方法

3.3.1 孔雀石绿的自然脱色

3.3.2 菌株S27降解染料特性研究

3.3.3 不同生理条件对菌株S27降解孔雀石绿的影响

3.3.4菌株的生长曲线测定

3.3.5 菌株27降解孔雀石绿的产物分析

3.4 结果与分析

3.4.1 孔雀石绿在自然条件下具有稳定的分子结构

3.4.2 菌株S27在染料脱色中具有特异性

3.4.3不同生理条件对菌株S27降解孔雀石绿的影响

3.4.4 不同浓度孔雀石绿对菌株S27生长曲线的影响

3.4.5菌株S27能够改变孔雀石绿的分子结构

3.4.6菌株27降解孔雀石绿的产物分子结构研究

3.5 讨论

第四章植物内生菌Klebsiella aerogenesS27降解孔雀石绿的分子机制及新型三苯甲烷还原酶KaTMR的性质研究

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 主要实验材料

4.3 实验方法

4.3.1潜在活性酶的分离纯化及活性测定

4.3.2三苯甲烷还原酶KaTMR的生物信息分析

4.3.3 三苯甲烷还原酶KaTMR的基因克隆和异源表达

4.3.4 三苯甲烷还原酶KaTMR降解孔雀石绿的分子机制

4.4 结果与分析

4.4.1 菌株S27潜在孔雀石绿降解酶的分离纯化及活性测定

4.4.2三苯甲烷还原酶KaTMR的生物信息分析

4.4.3 三苯甲烷还原酶KaTMR的基因克隆和异源表达

4.4.4三苯甲烷还原酶KaTMR降解孔雀石绿的分子机制

4.5讨论

第五章 孔雀石绿降解产物的毒性分析

5.1引言

5.2.1 实验材料

5.2.2 主要仪器和试剂

5.3 实验方法

5.3.2三苯甲烷还原酶KaTMR降解孔雀石绿的产物毒性分析

5.4 结果与分析

5.4.1内生菌Klebsiella aerogenes S27降解孔雀石绿的产物毒性分析

5.4.2三苯甲烷还原酶KaTMR降解孔雀石绿的产物毒性分析

5.5 讨论

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表论文、专利申请以及获奖情况

致谢