盐地碱蓬SsNRT1.7在硝态氮再利用过程中的功能研究

摘要

盐地碱蓬（Suaeda salsaL.）是一种具有高耐盐性的真盐生植物，在潮间带和内陆生境中长势良好，但其生长环境中特别是潮间带生境土壤中的NO3-含量非常低，但目前尚不清楚这两种生境的盐地碱蓬是如何适应低氮环境的。本文探究了两种生境盐地碱蓬对低氮环境适应的生理及分子机制。结果如下： 1．N饥饿对盐地碱蓬NO3-由源到库再利用的影响 将两种生境盐地碱蓬在200mM NaCl条件下用1mM NO3--N预培养。然后将幼苗用1mM NO3--N和无N溶液（N饥饿）一起培养14天后，测定与NO3-再利用相关基因的表达、NO3-和叶绿素含量、净光合速率以及生物量。结果表明，N饥饿处理后，与内陆生境相比，潮间带生境盐地碱蓬SsNRT1.7在老叶和成熟叶中的表达显著上调，但在幼叶中并非如此。并且潮间带生境NO3-和叶绿素含量、幼叶净光合速率和地上部干重的下降幅度均低于内陆生境。因此，与N饥饿处理后的内陆生境相比，SsNRT1.7可能在潮间带生境的老叶或成熟叶的NO3-再活化过程中发挥了更重要的作用。因此，在低氮环境中，相比于内陆生境，潮间带生境幼叶中更多的NO3-能够更好地维持光合作用。 2．盐地碱蓬NO3-再利用相关基因SsNRT1.7的全长克隆 根据盐地碱蓬转录组测序结果得到的NO3-再利用相关基因NRT1.7信息，克隆得到中间序列（暂命名为SsNRT1.7），将该序列进行blast比对分析，结果显示该序列与甜菜的NRT1/PTR FAMILY2.12蛋白的相似度为81%。以该序列为基础通过3'RACE和5'RACE技术扩增得到SsNRT1.7基因的全长2375bp,CDS区1851bp。编码区与拟南芥AtNRT1.7编码区的同源性为55.83%。 3．盐地碱蓬SsNRT1.7的生物信息学分析及亚细胞定位 SsNRT1.7编码617个氨基酸。对该蛋白进行理化性质分析，该蛋白为疏水稳定蛋白；将其氨基酸序列进行SMART分析，存在PTR2保守结构域；用TMHMM软件对蛋白的跨膜结构进行分析，该蛋白存在12个跨膜结构域；利用MEGA软件对该基因的蛋白序列进行系统进化分析，发现该蛋白与甜菜、菠菜、藜麦的亲缘关系最近。将SsNRT1.7基因连接到表达载体pCAMBIA1300-35S-sGFP上，经农杆菌转化测序成功后，对烟草进行瞬时转化，用双光子激光扫描共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞内SsNRT1.7和GFP的融合表达情况。结果显示，转空载体pCAMBIA1300-35S-sGFP的细胞内布满了绿色荧光，而转SsNRT1.7的烟草表皮细胞只有细胞膜有绿色荧光，表明SsNRT1.7定位于细胞膜。 4．拟南芥AtNRT1.7突变体、SsNRT1.7转基因纯合株系的筛选 我们选取SALK_022429拟南芥突变体株系，利用双引物法进行鉴定，获得了SALK_022429纯合植株。将SsNRT1.7基因连接到表达载体pCAMBIA1300-35S-sGFP上，经农杆菌转化测序成功后，对纯合突变体植株和WT植株进行花序侵染，获得过表达和回补植株，利用潮霉素抗性筛选出阳性植株，并进行DNA水平的验证，最终获得纯合过表达和回补株系，并根据荧光定量PCR结果筛选出表达量较高的株系。

目录

声明

文献综述

1 土壤盐渍化

2 盐生植物

2.1 盐生植物的概述

2.2 盐生植物的分类

2.3 盐生植物的耐盐机理

3 硝态氮在植物营养中的研究进展

3.1 植物对NO3-的吸收和储存

3.2 植物对NO3-的重新利用

4 本文研究的目的及意义

第一部分 氮饥饿对盐地碱蓬NO3- 由源到库重新利用的影响

1 试验材料与处理方法

1.1 试验材料

1.2 材料处理

2 试验方法

2.1盐地碱蓬NO3-再利用相关基因的筛选及表达量测定

2.2 N饥饿处理下盐地碱蓬NO3-再利用相关生理指标的测定

2.3 数据的统计分析

3 结果与分析

3.1 盐地碱蓬NO3-再利用相关基因的筛选

3.2 N饥饿处理对盐地碱蓬NO3-再利用相关基因表达量的影响

3.3 N饥饿处理对盐地碱蓬NO3-含量的影响

3.4 N饥饿处理对盐地碱蓬叶绿素含量的影响

3.5 N饥饿处理对盐地碱蓬净光合速率的影响

3.6 N饥饿处理对盐地碱蓬地上部干重的影响

4 讨论

第二部分 盐地碱蓬硝酸根转运蛋白SsNRT1.7基因全长的克隆及载体的构建

1试验材料与处理方法

1.1 试验材料

1.2 试验设计

2.1 提取RNA

2.2 cDNA的合成

2.3 目的基因中间片段的获得

2.4 3' RACE扩增硝酸根转运蛋白SsNRT1.7基因3'端序列

2.5 5' RACE扩增硝酸根转运蛋白SsNRT1.7基因5'端序列

2.6 RACE后序列验证

2.7 盐地碱蓬硝酸根转运蛋白SsNRT1.7目的基因的获取

2.8 表达载体的构建

3 结果与分析

3.1 盐地碱蓬叶片总RNA的提取与质量鉴定

3.2 盐地碱蓬硝酸根转运蛋白SsNRT1.7基因中间片段的获得

3.3 3' RACE扩增盐地碱蓬硝酸根转运蛋白SsNRT1.7基因3'端序列

3.4 5'RACE扩增盐地碱蓬硝酸根转运蛋白SsNRT1.7基因5'端序列

3.5 RACE后序列验证

3.6 盐地碱蓬硝酸根转运蛋白SsNRT1.7目的基因的获取

3.7 表达载体的构建

4 讨论

第三部分 盐地碱蓬硝酸根转运蛋白SsNRT1.7基因的生物信息学分析及亚细胞定位

1 试验材料与方法

1.1 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的生物信息学分析

1.2 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的亚细胞定位

2 结果与分析

2.1 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的一级结构及理化性质分析

2.2 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的疏水性分析

2.3 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的二级结构分析

2.4 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的跨膜结构分析

2.5 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的保守结构域分析

2.6 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的三级结构预测

2.7 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的系统进化分析

2.8 盐地碱蓬SsNRT1.7基因的亚细胞定位分析

3 讨论

第四部分 拟南芥SsNRT1.7突变体株系、过表达株系和回补株系的获得

1 试验材料

2 试验方法

2.1 拟南芥SsNRT1.7纯合过表达株系的筛选

2.2 拟南芥纯合突变体的筛选

2.3 拟南芥SsNRT1.7纯合回补株系的筛选

3 结果与分析

3.1 拟南芥SsNRT1.7纯合过表达株系的获得

3.2 拟南芥纯合突变体的获得

3.3 拟南芥SsNRT1.7纯合回补株系的获得

4 讨论

参考文献

攻读硕士学位期间参与课题及发表的论文

致谢