苹果果实酸度相关基因的筛选、克隆及表达分析

摘要

苹果(MalusdomesticaB.)是世界上最重要的鲜食和加工果品之一。苹果和以苹果浓缩汁为主的加工业成为我国加入世贸组织以后最具国际市场竞争力的优势农产品之一。我国长期以鲜食苹果栽培为主，主栽品种如富士系列、元帅系列、嘎啦系列等均偏甜而少酸，导致加工产品酸度低，出口效益较低，生产上迫切需要发展适宜加工的酸度高的品种。为了研究苹果酸度调控机制，本文利用分子标记、分析代谢关键酶和cDNA-AFLP差异显示的方法对控制果实酸度的基因进行了研究。主要结果如下： 1.苹果果实酸/非(低)酸性状的SSR标记分析 利用苹果上开发的140对SSR引物对东光和富士的F1代群体进行了酸、非酸性状的分子标记筛选，得到一个与果实酸性状连锁的SSR标记(CH03d12)，遗传距离为8.89cM。共显性分析表明酸(Ma)对非酸(ma)为完全显性。 2.热硼酸法提取苹果果实RNA的改良 在原热硼酸法的基础上加入一些提取辅助剂并根据辅助剂的特性优化提取步骤，改良后的方法可以有效去除蛋白和多糖，从而可以从不同发育阶段的苹果果实中高效、稳定的提取高质量的RNA，所得RNA的A260/A230大于2.0，A260/A280介于1.8-2.1之间。所得RNA产量高，其中前期果实RNA产率在13.40μg/g之上，后期果实RNA产率在7.02μg/g之上。3.苹果果实细胞质型苹果酸脱氢酶(cyMDH)基因的分离及其特征 利用不同物种的同源序列设计简并引物，通过RT-PCR和RACE-PCR技术分离了富士苹果果实中的细胞质型苹果酸脱氢酶基因，命名为Mal-cyMDH,其全长为1,246bp，GenBank注册号为DQ221207，基因组序列分析表明编码区含有7个外显子和6个内含子。推断的蛋白序列分析表明，Mal-cyMDH大部分氨基酸区域为亲水结构，有2个推测的跨膜结构区，其中在N端第9个氨基酸下游存在一个26氨基酸的强疏水结构域，这种结构也发现于其它动植物和微生物的cyMDH中。同源性比较发现，该基因的氨基酸序列与其它植物具有90％以上的同源性，尤其是与双子叶植物的同源性更高，其中与桃子的同源性最高，达到96％；与动物和微生物的同源性也在50％以上。同时在该序列中也发现了cyMDH蛋白中高度保守的NAD结合基元TGAAGQI和催化基元“IWGNH”。这都说明本试验成功地从苹果果实中克隆了cyMDH。 4.Mal-cyMDH的Southernblotting分析 BamHI，EcoRV和XbaI三种酶切后杂交结果显示在苹果基因组中cyMDH可能存在三个拷贝。 5.Mal-cyMDH的NorthernBlotting分析 苹果不同组织杂交表明，Mal-cyMDH在幼嫩的叶片、茎和发育后期的果实中大量表达，在根部表达较弱。cyMDH转录水平受果实发育调节，在两种基因型后代果实中，该基因表达模式相似，都随着果实的发育表达强度逐渐增加，直到花后90天左右趋于稳定。就两个基因型的表达差异而言，花后7-60天，cyMDH在高酸果实中的表达强于低酸果实；而花后75-120天低酸苹果的表达信号反而有所加强；成熟期表达量则相似。苹果酸含量测定表明在对应发育时期高酸基因型苹果酸含量明显高于低酸基因型。可见，在转录水平上cyMDH的不同基因型的表达与苹果酸含量的差异可能没有相关性。6.原核表达及动力学参数测定将Mal-cyMDH基因编码区克隆到原核表达载体pET30a-c(+)在OrigamiB(DE3)中表达了部分可溶的融合蛋白，酶活检测发现重组蛋白具有较高的苹果酸脱氢酶活性。融合蛋白动力学参数测定结果显示，以OAA和NADH为底物的苹果果实cyMDH的Kcat和Kcat/kin远高于以Malate和NAD+为底物，说明苹果果实中细胞质型苹果酸脱氢酶主要催化苹果酸的合成。与以Malate为底物相比，苹果果实中以OAA为底物cyMDH有高的Km和Vmax。Malate和OAA的竞争力分别高于NAD+和NADH。 7.高酸、低酸基因型中苹果酸代谢关键酶的半定量PCR分析 高酸、低酸基因型中苹果酸代谢关键酶基因的半定量RT-PCR结果表明，催化苹果酸合成的PEPC，负责苹果酸降解的ME以及运输、储藏有关的H+-ATPaseA在两基因型间没有表现出明显差异，而调控苹果酸运输、储藏的另一个关键酶基因V-Ppase从花后90天左右在两基因型间表现出了明显差异，即高酸基因型明显高于低酸基因型。 8.苹果果实酸度相关基因的cDNA-AFLP差异筛选 采用64对AFLP引物组合对酸/低酸cDNA基因池进行筛选，其中引物组合EcoRI-AAC/MseI-CAA在两个基因池间产生120bp左右多态性片断，进一步验证表明在6个高酸cDNA池成员和6个低酸cDNA池成员间表现出连续的差异，初步认为该基因与果实低酸性状有关，命名为Mal-DDNA。 9.Mal-DDNA基因分离及其特征 根据差异筛选所获得的中间片段、5'片段和3'片段的重叠区域拼接出Mal-DDNA全长cDNA，该基因全长3,728bp，GenBank注册号为DQ417661。DAS-TMfilter和TMpred分析表明Mal-DDNA推断的蛋白不存在跨膜结构。LOCSVMpsi亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞核(期望的准确率为89％)，但PSORT预测的亚细胞定位于细胞质(可信度为0.65)。基因银行Blast分析表明Mal-DDNA及其推测的蛋白序列没有明显同源的基因。 10.Mal-DDNA的Southernblotting分析 EcoRLEcoRV和XbaI三种酶切后杂交结果显示在苹果基因组中cyMDH可能以单拷贝形式存在。 11.Mal-DDNA的RT-PCR和NorthernBlotting分析 苹果不同组织(包括根、茎、叶和果实)杂交表明，Mal-DDNA在果实中专一性表达。不同发育阶段的果实杂交显示Mal-DDNA转录水平受果实发育调节，在高酸和低酸两种基因型后代果实中该基因表达模式相似，总体上都随着果实的发育表达强度逐渐增加，但两个基因型间存在明显的差异，低酸基因型的表达要明显高于高酸基因型。在低酸基因型中该基因表达逐渐增强，除了在花后90天有一小幅度下降，后期的表达量明显强于早期。在高酸基因型中该基因表达微弱，在花后120天才检测到该基因的表达。Mal-DDNA的转录水平与苹果酸含量相比较，两者呈负相关，即随着苹果酸含量的降低Mal-DDNA的转录水平逐渐升高。

目录

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摘要

1前言

2材料和方法

3.结果与分析

4讨论

5结论

参考文献

附录

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