小麦籽粒中淀粉去分支酶的活性差异、类型及作用机制的研究

摘要

淀粉去分支酶(DebranchingEnzyme,DBE)是小麦支链淀粉合成的关键酶。本文在优化小麦中淀粉去分支酶提取以及活性分析条件的基础上，比较了不同小麦品种和不同灌浆时期淀粉去分支酶活性的变化，并对小麦中淀粉去分支酶进行了分离纯化和有关酶学性质的研究，以期为今后深入研究小麦支链淀粉合成机理提供理论依据。主要研究结果如下：1小麦中淀粉去分支酶的提取和活性分析条件的优化 以纯的商品化的马铃薯支链淀粉为底物，对小麦中淀粉去分支酶提取和活性分析条件进行了研究。结果表明，巯基乙醇加入量对酶活性影响较大。随着巯基乙醇加入量的增大，酶活性呈现上升的趋势，当巯基乙醇加入量达到50mmol/L，酶活性达到最大值。再增加巯基乙醇的浓度，对酶活性仅具有稳定作用。缓冲液的类型和pH值对酶活性也有较大影响，随着pH值的增大，酶活性均呈现先增加后减少的趋势，当缓冲液为MES-NaOH，pH为6.5时酶活性达到最大值。 酶促反应以30℃为宜，在此条件下反应120min内酶活性分析结果具有稳定性。 据此，小麦中淀粉去分支酶提取条件为：巯基乙醇加入量为50mmol/L，以pH为6.5的MES-NaOH作为提取缓冲液；而小麦淀粉去分支酶活性分析条件为：酶促反应温度为30℃，反应时间为120min内，测定波长为540nm。 2不同品种小麦淀粉去分支酶在不同时期的活性变化以四个小麦品种(糯)麦1号、关东107、鲁麦21、济南16为材料，其中糯麦1号为全糯性小麦，关东107为部分糯性小麦，后两种为普通小麦。研究了不同品种小麦淀粉去分支酶在不同时期的活性变化。研究表明，小麦开花至成熟的全过程中，淀粉去分支酶的活性变化呈单峰曲线。从曲线的形式来看，四种小麦的淀粉去分支酶，在灌浆的不同时期其活性变化趋势大体上一致，表现为：开花后活性快速上升，在开花后14d前后达到峰值，然后下降，但保持在较高水平，随着小麦的成熟，开花35d后活性下降迅速。 3小麦淀粉去分支酶的分离纯化采用硫酸铵沉淀法和DEAE-Cellulose离子交换层析法对小麦中淀粉去分支酶进行分离纯化，得到异淀粉酶和极限糊精酶两个酶组分，利用SephacrylS-200聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱层析对主要组分异淀粉酶进一步纯化，能得到纯度较高的异淀粉酶，该酶的纯化倍数提高了3.66倍，得率为10，酶比活为4.021U/μgProtein。 4异淀粉酶的酶学性质研究异淀粉酶的酶学性质研究表明：该酶最适pH为6.5，最适温度为30℃，热稳定范围在30-40℃之间，其分子量大约为89.9kDa和56.8kDa，对其底物-支链淀粉的米氏常数为8.045mg/mL，最大反应速度为12.24U/L。Hg2+和Cu2+对此酶有很强的抑制作用，Na+、Mg2+等对此酶几乎无抑制作用，而甘油和巯基乙醇对此酶有稳定作用，纯化过程中能保持该酶的活性。异淀粉酶在4℃下保存一个月，其活性仍在80％以上。 5淀粉去分支酶对其底物-支链淀粉的酶解性质研究四种小麦粗酶液酶解支链淀粉后产物的液相色谱图，其趋势相似，具有明显的两个峰，保留时间分别为3-5min和16-18min之间。与三种糖标准样品曲线相比，可知与第一个峰相对应的物质为葡萄糖。说明尽管四个小麦品种的淀粉组分差异很大，但他们的淀粉去分支酶对底物支链淀粉都有相似的酶解活性。 糯麦1号和鲁麦21两个品种小麦的粗酶液经DEAE-Cellulose部分纯化，得到有活性的异淀粉酶作用于支链淀粉，有HPLC图谱可以看出，这两个品种小麦淀粉去分支酶经部分纯化后也具有相似趋势的图谱，但具有相似的四个峰，其中第一个峰和最后一个峰与未纯化酶液图谱中的相应的两个峰相似，保留时间分别在3-5min和16-18min。这不但进一步说明了以上的结论，而且还说明其粗酶液中可能含有可以作用于支链淀粉的其他水解酶类如淀粉酶等。

目录

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第一章文献综述

第二章小麦淀粉去分支酶的活性分析

第三章淀粉去分支酶的分离纯化及酶学性质研究

参考文献

致谢