不同免疫抑制病毒感染及其共感染对鸡细胞免疫反应的影响

摘要

免疫抑制性病毒是一类能够引起被感染动物个体免疫功能下降，造成对某些病原易感性增强的一类病毒。在鸡群中，网状内皮增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽呼肠孤病病毒(ARV)等都是常见的免疫抑制性病毒，有关它们造成的免疫抑制在一些文献都已有所报道。最近的流行病学调查表明，这些病毒往往可在鸡群形成二重感染或三重感染、甚至四重感染，但这种多重感染对鸡群免疫功能的影响，国内外的研究还较少。机体的免疫功能包括体液免疫和细胞免疫，而淋巴细胞增殖反应是反映机体细胞免疫状态的一个重要指标。检测淋巴细胞增殖反应的方法最常用的是3H-TdR掺入法，该方法稳定、灵敏和客观。本研究对影响该方法的一些因素进行优化，并利用该方法对不同剂量REV感染、REV与ALV-J、REV与MDV、REV与ARV共感染鸡后对淋巴细胞增殖反应的影响进行了检测和比较研究。一淋巴细胞增殖试验中相关参数的优化 用3H-TdR掺入法检测外周血、脾脏、胸腺、法氏囊中淋巴细胞的增殖反应，对影响该方法的淋巴细胞浓度、丝裂原浓度(ConA或LPS)、犊牛血清(FCS)浓度等参数条件进行优化。结果表明外周血淋巴细胞增殖试验的最佳条件为细胞浓度10％5～106/ml，ConA的浓度为5μg/ml，FCS浓度为10％；脾脏中淋巴细胞最佳条件细胞浓度为5×106/ml，ConA的浓度为5μg/ml，FCS浓度为10％；胸腺中淋巴细胞最佳条件为细胞浓度106/ml，ConA的浓度为40μg/ml，FCS浓度为10％；法氏囊中淋巴细胞最佳条件为细胞浓度5×106/ml，LPS的浓度为40μg/ml，FCS浓度为10％。这些条件的优化为检测免疫抑制病毒感染对鸡不同免疫组织淋巴细胞增殖的反应奠定基础。 二不同剂量REV对感染鸡细胞免疫反应的影响 用不同剂量的网状内皮增生症病毒(REV)感染商品代肉鸡(高剂量为104个TCID50REV/只；低剂量为2×103个TCID50REV/只)和SPF鸡(高剂量为104个TCID50REV/只；低剂量为103个TCID50REV/只)后，，检测血液中T淋巴细胞对ConA的反应和NK细胞、细胞毒T细胞(CTL)的细胞毒性作用以及NDV、AIV疫苗抗体生成变化等，并结合体重、胸腺、法氏囊等重量变化进行统计分析。结果表明感染REV各组肉鸡外周血淋巴细胞对ConA反应均有不同程度下降，高剂量感染即REV(104个TCID50REV/只)组下降显著(P＜0.05)，而低剂量感染即REV(2×103个TCID50REV/只)组在49日龄也显著下降(P＜0.05)。SPF鸡感染试验中REV高剂量(104个TCID50REV/只)组T细胞对ConA的反应极显著降低(P＜0.01)，而低剂量感染(103个TCID50REV/只)时，T细胞对ConA的增殖反应有降低趋势，但差异不显著(P＞0.05)。感染REV后商品代肉鸡NK细胞对MSB-1杀伤百分率有不同程度增加，高剂量感染组在39日龄增加显著(P＜0.05)，在49日龄组内鸡只之间差异较大，显示不同反应；低剂量感染组在49日龄比对照组显著升高，显示较强的杀伤活性。对感染SPF鸡其CTL杀伤活性表现较强的增加。无论高剂量还是低剂量REV均抑制感染肉鸡和SPF鸡对NDV、AIV(H5、H9)疫苗抗体生成滴度，但存在程度上的差异；对感染SPF鸡的生长、胸腺、法氏囊的发育具有显著的抑制作用。这种结果说明REV可引起感染鸡的非特异性细胞免疫反应和体液免疫反应以及免疫器官发育等的抑制，但可激活特异性细胞免疫的杀伤活性，显示REV免疫抑制的选择性特点和感染病毒量不同造成程度的差异性。 三REV和ALV-J共感染对鸡细胞免疫反应的影响 在以REV和ALV-J单一感染和共感染后不同时间，采用3H-TdR掺入法测定血液和脾脏的淋巴细胞对ConA增殖反应能力。结果表明，血液淋巴细胞对ConA增殖反应能力在REV和ALV-J感染后第7天均出现下降，REV单一感染组在第17、37天均极显著低于对照组(P＜0.01)，ALV-J单一感染组也呈现下降趋势。在脾淋巴细胞反应中REV感染组在感染后第37天极显著降低(P＜0.01)，ALV-J组显著降低(P＜0.05)。REV和ALV-J共感染抑制淋巴细胞对ConA增殖反应较单一感染更强，效应期也更长，在感染后第37天，共感染对血液和脾淋巴细胞反应的抑制作用均大于REV和ALV-J的单一感染(P＜0.05)。在第27、37天检测NDV抗体，单一感染组降低显著(P＜0.05)，而共感染组下降极显著(P＜0.01)，较单感染组也显著降低(P＜0.05)。本研究表明REV、ALV-J感染不仅抑制体液免疫反应，也抑制细胞免疫反应，且共感染比单一感染的抑制作用更强。 四REV与MDV共感染对鸡细胞免疫反应的影响 一定感染量的REV和MDV分别感染1日龄肉鸡(REV组：2×105TCID50/只；MDV组：2000PFU/只；REV+MDV组：1000PFUMDV+105TCID50REV/只)和SPF鸡(REV组：2x105TCID50/只；MDV组：2000PFU/只；REV+MDV组：2000PFUMDV+2×105TCID50REV/只)，对照组注射同等剂量的细胞培养液，7日龄免疫接种NDV、AIV(H5、H9)疫苗，选取感染后21、42日，无菌取血液，42日无菌取脾脏，用3H-TdR掺入法检测淋巴细胞对ConA的增殖反应；42天用HI试验检测血液中NDV、H5、H9抗体生成变化；并结合体重、主要免疫器官重量的变化，统计分析各组差异显著性。结果表明：商品代肉鸡感染REV和MDV后，血液中淋巴细胞的转化水平极显著下降(P＜0.01)，脾淋巴细胞转化水平也分别显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)下降，共感染组较对照组极显著下降(P＜0.01)，尽管较单一感染有下降趋势，但差异不显著(P＞0.05)。REV或MDV单一感染后造成细胞毒T淋巴细胞杀伤活性升高，其中MDV感染组升高显著(P＜0.05)，但在共感染组肉鸡血液和脾脏CTL活性出现下降，在脾淋巴细胞表现显著(P＜0.05)。在SPF鸡试验中，单一感染REV和MDV后，外周血和脾脏淋巴细胞转化反应显著下降(P＜0.05)，共感染组较对照组下降极显著(P＜0.01)，相对单一感染组也显著下降(P＜0.05)。CTL杀伤活性显示的规律与肉鸡基本相似，REV感染造成的CTL杀伤活性高于MDV感染，在共感染外周血和脾脏内CTL杀伤活性呈现下降。对NDV和AIV疫苗抗体生成能力和体重的影响在肉鸡和SPF鸡试验都呈现共感染较单一感染更为显著的免疫抑制。结论：REV与MDV共感染进一步加重单一感染对机体的细胞免疫抑制，且抑制特异性T淋巴细胞对MD肿瘤细胞的杀伤活性，改变了B、T淋巴细胞的免疫反应活性。 五网状内皮增生症病毒(REV)和禽呼肠孤病毒(ARV)对感染鸡群免疫状态的影响 1日龄SPF鸡单一或共感染不同株REV(REV-CS株和REV-HA株)和不同株ARV(ARV-DL株和ARV-CHX株)，运用3H-TdR掺入法和间接血凝抑制试验(HI)分别检测机体T淋巴细胞转化和抗体生成的变化，并对感染鸡生长和免疫器官的发育进行分析。结果表明REV-CS株和REV-HA株感染SPF鸡后血液和脾脏淋巴细胞对ConA反应均呈现显著(P＜0.05)下降；单一感染ARV-DL株和ARV-CHX株也均导致鸡淋巴细胞转化反应显著下降(P＜0.05)；REV-CS株与ARV-DL株共感染可导致血液和脾脏淋巴细胞对ConA反应极显著下降(P＜0.01)；与REV-CS组相比较，血液淋巴细胞转化显著下降(P＜0.05)；较ARV-DL组，下降不显著(P＞0.05)；脾脏淋巴细胞转化介于REV单一感染和ARV单一感染之间，两两比较差异均不显著。REV-HA株和ARV-CHX株共感染后血液和脾脏淋巴细胞的转化极显著低于对照(P＜0.01)，但相对REV-HA株和ARV-CHX株单一感染，血液和脾脏淋巴细胞的转化均没有显著差异，刺激指数大小相近。两个不同地方株REV感染的鸡出现明显的生长滞缓(P＜0.01)，胸腺、法氏囊萎缩(P＜0.05)和对NDV和AIV疫苗反应抗体生成显著减少(P＜0.01)；而不同地方株ARV感染对鸡免疫器官发育和疫苗反应抗体生成的变化影响不显著(P＞0.05)；不同株的两种病毒共感染对疫苗抗体生成能力、免疫器官发育和生长等的影响没有呈现比REV单一感染更为严重的免疫抑制，其造成的免疫抑制程度虽较ARV单一感染具有显著差异，推测可能由于两种病毒共感染中REV引起的。这些结果说明ARV感染引起的免疫抑制比REV缓和，并不加重REV引起的免疫抑制。 结论 用3H-TdR掺入法检测REV与ALV-J，REV与MDV，REV与ARV共感染鸡后淋巴细胞增殖反应的变化，证实REV与ALV-J，REV与MDV共感染可以增强单一感染造成的细胞免疫抑制，但REV与ARV共感染未见进一步加重单一感染引起的非特异性细胞免疫抑制，显示REV与其它免疫抑制病毒共感染加重免疫抑制是有选择性的。

目录

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英文缩写注释

文献综述

引言

实验研究部分

实验一3H-TdR掺入法检测鸡不同组织淋巴细胞增殖反应的条件优化

实验二不同感染量REV对鸡免疫反应和细胞毒性作用的影响

实验三REV和ALV-J感染对肉用型鸡细胞免疫反应的影响

实验四网状内皮增生症病毒与马立克氏病病毒共感染对鸡细胞免疫反应的影响

实验五REV和ARV感染对SPF鸡细胞免疫反应的影响

总体结论

创新之处

参考文献

致谢

附