H9N2亚型猪流感病毒M1、NS1、NP基因的原核表达和NP-ELISA检测技术的研究

摘要

猪流感(Swine influenza，SI)是由猪流感病毒(Swine influenza，virus，SIV)引起的不同日龄、性别和品种猪的一种急性、热性和高度接触性的呼吸道传染病。其特征为疾病突发，高热，精神沉郁，食欲废绝，呼吸困难，阵发性咳嗽。SI的病死率不高，病猪可迅速康复，但是随着集约化养猪规模的不断扩大，SI对养猪业构成了较大的威胁。1918年美国首次报道了SI的暴发，1930年Shope从猪体中分离到了H1Nl亚型SIV。迄今为止，SI已遍布美、欧、亚、非等世界各地。SI除具有兽医学意义外，更为重要的是生态学和公共卫生意义。目前，SI已成为研究的热点。研究快速、科学、准确的诊断方法对于本病的检测和控制具有很大的意义。 本研究用接种鸡胚的病毒增殖方法大量增殖分离株A/swine/Hangzhou/1/2006(I{9N2)，增殖病毒经差速离心进行纯化，经超速离心浓缩。根据Genbank发表的SIV结构蛋白M1、NP和非结构蛋白NS1基因核苷酸序列，设计1条通用引物Unit，进行反转录获取eDNA；设计特异性引物Pm1/Pm2、Pnp1/Pnp2、Pns1/Pns2用以扩增M1、NP和NS1基因。通过PCR技术，从病毒基因反转录产物cDNA中扩增出病毒结构蛋白M1、NP和非结构蛋白NS1目的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体，然后定向克隆到表达载体pET-28a中。提取重组质粒经PCR．鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。将重组质粒pET-M1，pET-NS1和pET-NP转化到表达宿主菌BL21(DE3)/Rosetta<'TM>(DE3)中，经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导，高效表达了M1、NP和NS1蛋白，分子质量约为31.4 kD、55.1kD和27kD。经Western-Blot检测表明，表达的重组蛋白均能够被SIV阳性血清所识别，具有良好的抗原性。此结果为SI新型免疫学诊断试剂以及亚单位疫苗的研制奠定了基础。 用纯化的H9N2亚型SI可溶重组NP蛋白作为包被抗原，建立了检测SI抗体的间接ELISA方法，并确定了ELISA最佳工作条件：抗原包被浓度为12.5μg/ml，37℃1h加4℃过夜，血清(1：40)和SPA(1：10000)分别在37℃温育40 min，底物溶液37℃显色15 min。经重复性试验、交叉试验、竞争抑制试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高；利用’rG．ROC软件确定了自制ELISA(NP-ELISA)酶标板的临界值为0.20，特异性和敏感性分别为95.83％和91.43％。与美国IDEXX试剂盒相比较，符合率为94％，无显著性差异。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本356份，总阳性率为35.40％。为进一步组装成诊断试剂盒奠定物质基础，为SIV的诊断与监测提供了一种良好的技术手段。

目录

声明

英文缩略表

文献综述

第一章H9N2亚型猪流感病毒M1、NS1基因的原核表达

1材料

1.1质粒和菌株

1.2工具酶及主要试剂

1.3常用缓冲液及培养基配置

2方法

2.1猪流感M1、NS1基因的原核表达载体的构建与序列分析

2.2原核表达、鉴定及表达条件优化

2.3重组表达蛋白的纯化

2.4表达蛋白的免疫原性分析

3结果

3.1 M1、NS1基因的扩增及M1基因T-载体的克隆

3.2 pET-M、pET-NS1的克隆及鉴定

3.3M1、NS1基因序列测定

3.4 M1、NS1基因表达及重组蛋白的纯化

3.5重组表达蛋白Western-blot检测

3.6重组表达蛋白NS1 ELISA检测

4讨论

第二章H9N2型猪流感病毒NP基因的原核可溶表达

1材料

2方法

2.1猪流感NP基因的原核表达载体的构建与序列分析

2.2原核表达、鉴定及表达条件优化

2.3重组NP蛋白的非变性Ni-NTA纯化

2.4表达蛋白的免疫原性分析

3结果

3.1 NP基因的扩增、克隆及鉴定

3.2 pET-NP重组质粒的鉴定

3.3 NP基因的表达

3.4重组蛋白NP的可溶性分析

3.5重组蛋白NP的非变性纯化

3.6 NP表达蛋白的Western-blot检测

4讨论

第三章重组NP蛋白抗原检测SIV抗体间接ELISA方法的建立

1材料与方法

1.1主要试剂

1.2血清及病毒

1.3重组N蛋白抗原最适包被浓度和抗体最佳稀释度的确定（棋盘法）

1.4抗原包被条件的确定

1.5封闭液的确定

1.6封闭时间的确定

1.7血清最佳反应时间的确定

1.8酶标二抗(SPA)工作时间的确定

1.9间接ELISA操作程序和结果判定

1.10特异性试验

1.11重复性试验

2结果

2.1抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定

2.2重组N蛋白抗原包被条件的确定

2.3封闭液的确定

2.4封闭时间的确定

2.5血清最佳反应时间的确定

2.6酶标SPA工作时间的确定

2.7间接ELISA判定标准的确定

2.8特异性试验

2.9重复性试验

2.10与IDEXX公司试剂盒比较试验

2.11临床血清样本的检测

3讨论

结论

参考文献

致谢

附录A常用缓冲液及溶液配制

附录B：仪器及试剂

附录C：SIV M、NP、NS1基因克隆表达技术路线

攻读学位期间发表的论文