H3N8亚型马流感病毒内蒙古株全基因序列分析及NS1基因的原核表达

摘要

马流感（Equine influenza，EI）是由马流感病毒引起的一种急性、高度接触性的马属动物呼吸道传染病。近年来，随着国际马术赛事的蓬勃兴起以及马属动物流动范围扩大等原因，致使EI在全球上频繁暴发、流行并由此对赛马业等构成了严重威胁。因此，从分子水平上阐明EIV H3N8亚型的流行规律，不仅在病毒学研究领域中有重要的学术意义，而且对EI防控也具有实用价值。 本研究先将内蒙古株A/equine/Inner Mongolia/8/08（H3N8）在SPF鸡胚中增殖，提取病毒核酸，根据EIV8个基因片段的3’末端高度保守的核苷酸序列特点，设计一条反转录引物，根据GenBank已发表的H3N8亚型EIV8个基因的cDNA序列，利用Oligo6.0设计并合成14对特异性引物，通过RT—PCR方法扩增出8个基因的序列片段，将它们连接到pMD18—T载体上。序列测定及分析结果显示，EIV8个基因的cDNA包含该病毒完整的开放阅读框，与美洲株Kentucky/02的同源率最高，HA，NA，NP，NS1，NS2，M1，M2，PA，PB1，PB2基因核苷酸序列的同源性分别为98.7％，99.0％，99.1％，99.5％，99.4％，97.5％，97.4％，98.7％，98.8％，99.2％，两者各基因有着相似的遗传演化过程。 本研究将全长700bp的NS1基因亚克隆到原核表达载体pET—32a中，经双酶切鉴定为阳性的重组质粒再转化到感受态细胞BL21（DE3）中，挑选含重组质粒pET—NS1的菌落，经SDS—PAGE分析表明，用IPTG（终浓度为0.8mmol/L）诱导培养5h，pET—NS1融合蛋白表达量达到高峰，以包涵体形式存在，目的蛋白与载体上的标签蛋白融合后大小约为46kDa，与理论值相符。Western—blot分析表明，融合蛋白能与H3N8亚型马流感病毒感染马阳性血清发生特异性反应，具有良好的抗原性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略语表

声明

1 引言

1.1 马流感概述

1.2 EIV的结构与理化特性

1.2.1 病毒的形态结构

1.2.2病毒的基因组结构

1.2.3病毒的理化特性

1.3 EIV生物学特性

1.3.1 血凝特性

1.3.2抗原性

1.4 EIV基因编码蛋白的结构和功能

1.4.1血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)

1.4.2神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase，NA)

1.4.3聚合酶蛋白(Polymerase)

1.4.4核蛋白(Nucleoprotein,NP)

1.4.5基质蛋白(Matrix,M)

1.4.6非结构蛋白(Nonstructural protein,NS)

1.5 EIV的复制

1.5.1 病毒粒子的侵入与脱壳

1.5.2 转录

1.5.3病毒基因组的复制

1.5.4病毒基因表达的调控

1.5.5病毒的装配及释放

1.6 EIV的进化

1.7本研究的目的和意义

2试验一EIV内蒙古株全基因组序列测定及分析

2.1 材料

2.1.1 病毒

2.1.2 SPF鸡胚

2.1.3载体和菌种

2.1.4试剂

2.1.5 引物

2.2方法

2.2.1病毒的增殖及保存

2.2.2病毒总RNA的提取

2.2.3 RT-PCR

2.2.4感受态细胞的制备

2.2.5 目的片段的纯化和回收

2.2.6连接克隆载体

2.2.7转化

2.2.8重组子的菌落PCR鉴定

2.2.9序列测定

2.2.10序列比较分析

2.2.11遗传进化分析

2.3 结果

2.3.1基因的扩增与克隆

2.3.2重组子的菌落PCR鉴定结果

2.3.3重组子测序鉴定

2.3.4序列比较分析

2.3.5遗传进化分析

2.4 讨论

2.5 结论

3试验二 EIV NS1基因的原核表达

3.1 材料

3.1.1 引物

3.1.2质粒和菌种

3.1.3试剂

3.2方法

3.2.1 NS1基因的PCR扩增及纯化

3.2.2重组表达载体的构建

3.2.3 NS1融合蛋白的表达及分析

3.2.4重组蛋白表达最佳诱导条件的确定

3.3结果

3.3.1 NS1基因的扩增

3.3.2重组表达载体双酶切鉴定

3.3.3目的基因表达和SDS-PAGE分析

3.3.4表达产物的可溶性分析

3.3.5表达产物的Western-blot检测与分析

3.3.6最佳诱导条件的确定

3.4 讨论

3.4.1关于pET-32a原核表达系统

3.4.2宿主菌的选择

3.4.3 马流感病毒内蒙古分离株NS1蛋白的原核表达

3.5 结论

致谢

参考文献

附录

作者简介