转AhBADH、PsCAT基因烟草和杨树的获得及其抗性分析

摘要

植物生长发育经常遇到的逆境以干旱、盐碱等最为严重，而干旱、盐碱胁迫通常伴随着强烈的光照，在干旱强光等逆境胁迫下会导致植物的渗透胁迫和氧化胁迫伤害，使叶绿体的结构和功能遭到破坏，以致光合作用大大降低。如果通过基因工程的手段将合成甜菜碱的关键酶基因和参与清除活性氧中过氧化氢的过氧化氢酶基因共同导入植物，发挥抗氧化、渗透调节和保护光合中心大分子蛋白质功能，将能有效的提高植物抗旱、抗高光强和耐盐等抗逆能力。因此，本研究将甜菜碱醛脱氢酶基因和过氧化氢酶基因转入烟草和杨树。转基因植物的获得也可为探讨植物抗逆的生理和分子机制以及具有高抗逆性状的转基因杨树的实际应用打下良好的基础。 主要实验结果如下： 1．将来自豌豆的过氧化氢酶基因PSCAT与叶绿体RuBP羧化酶小亚基转运肽(rbcS-3)基因(Tr)的融合基因与来自山菠菜的甜菜碱醛脱氢酶基因AhBADH基因构建在同一个表达载体中，并且使其分别具有独立的表达框，然后利用农杆菌介导的叶圆盘转化法将这两个基因导入烟草和杨树，并利用叶绿体RuBP羧化酶小亚基转运肽的作用使过氧化氢酶特异表达在叶绿体中。在含有抗生素的培养基上筛选获得单转AhBADH草和杨树、单转PSCAT烟草和杨树以及同时转这两个基因的烟草和杨树各30多个株系，并对其进行了分子生物学的鉴定和生理指标的检测。 2．PCR、Northern blot、植株总蛋白Western blot和叶绿体蛋白Western blot结果表明，目的基因已经整合到烟草和杨树的基因组中，并能正常表达，且在叶绿体rbcS-3转运肽的作用下能定向进入叶绿体中。 3．在20％PEG6000模拟干旱条件下，不同转基因的植株(包括单转AhBADH的烟草和杨树，单转PSCAT的烟草和杨树，以及同时转这两种基因的烟草和杨树)的质膜损伤程度、叶绿素降解程度和PS II的损伤程度都小于野生型，表明转AhBADH和PSCAT提高了植物的抗旱性。另外，结果表明同时转AhBADH和PSCAT植株的抗旱性要高于单转AhBADH和单转PSCAT的植株。 4．用不同浓度百草枯处理模拟氧化胁迫，结果表明不同转基因植株的抗氧化性高于野生型植株的抗氧化性，且转双价基因植株的抗氧化性高于单转AhBADH和单转PSCAT的植株。 5．经200 mM NaCl和高温/低温胁迫实验发现，不同转基因植株的抗逆能力均高于野生型植株，且转双价基因的植株高于单转AhBADH和单转PSCAT的植株。 总之，转．AhBADH和转PSCAT提高了转基因植株的抗氧化酶活性和渗透调节能力，从而提高了转基因植株的抗旱、抗氧化、耐盐和耐高/低温的能力。且同时过量表达AhBADH和PSCAT的植株更有效地提高了其抗逆性。

目录

论文说明：英文缩写符号及其中英文对照表

声明

1前言

1.1植物的抗旱性

1.2植物的抗氧化性

1.2.1植物中的活性氧产生及清除

1.2.2活性氧的酶促脱毒系统

1.2.3活性氧的非酶促清除及相关分子

1.3植物的耐盐性

1.3.1植物在组织器官水平上的耐盐机制

1.3.2植物在分子细胞水平上的耐盐机制

1.4植物对高温的抗性

1.4.1高温对植物光合作用的影响

1.4.2高温对植物生物膜的影响

1.5植物的抗冷性

1.5.1生物膜

1.5.2细胞骨架

1.5.3植物抗冷的分子机制

1.6甜菜碱研究进展

1.6.1甜菜碱对植物的保护作用

1.6.2甜菜碱在植物中的合成途经

1.7过氧化氢酶研究进展

1.7.1 CAT结构、功能、细胞定位以及分类

1.7.2影响CAT活性因素

1.7.3 CAT在抗氧化中的作用

1.7.4 Cat的克隆与序列分析

1.7.5 Cat的表达调控

1.7.6 CAT基因工程研究

1.8获得多价转基因植物的策略

1.8.1多基因和多个表达载体构建策略

1.8.2基因转化策略

1.9 MAR序列在消除基因沉默中的应用

1.9.1基因沉默现象

1.9.2使用MAR序列消除基因沉默

1.10杨树的研究进展

1.10.1常规育种

1.10.2三倍体毛白杨

1.10.3杨树的组织培养

1.10.4基因工程育种

1.11本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2农杆菌菌株和质粒

2.1.3试剂

2.1.4酶及生化试剂

2.1.5仪器

2.1.6 PCR引物

2.2研究方法

2.2.1 BT-18号三倍体毛白杨组培再生系统的建立

2.2.2植物表达载体的构建

2.2.3根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备及转化

2.2.4利用农杆菌介导分别转化烟草和杨树

2.2.5杨树叶片分化和生根培养基

2.2.6烟草和杨树再生植株的PCR检测

2.2.7凝胶电泳中DNA片段的回收

2.2.8 Northern杂交

2.2.9转基因植物的Western blot检测

2.2.8转化植株移栽

2.2.9转基因烟草CAT活性检测

2.2.10转基因植株在逆境处理下生理指标的测定

3结果与分析

3.1植物表达载体的构建

3.1.1目的片段的获得

3.1.2 双价基因载体的构建

3.1.3价基因载体的PCR鉴定及测序分析

3.1.4植物表达载体质粒转化农杆菌

3.2转基因植株的获得

3.3转基因植株的PCR检测

3.4转基因植株的Northern blot检测

3.5转基因植株的Western blot检测

3.6目的蛋白的叶绿体定位

3.7正常情况下各种转基因植株的CAT活性

3.8转基因植株的抗旱性分析

3.8.1转基因植株在20％PEG6000处理条件下的生长情况

3.8.2 PEG6000处理对不同转基因植株CAT活性的影响

3.8.3 PEG6000处理对不同转基因植株质膜透性的影响

3.8.4 PEG6000处理对不同转基因植株叶绿素含量的影响

3.8.5 PEG6000处理对不同转基因植株渗透势的影响

3.8.6 PEG6000处理对不同转基因植株叶绿素a荧光动力学的影响

3.8.7 PEG6000处理对不同转基因植株光合速率的影响

3.9转基因植株的抗氧化能力分析

3.9.1转基因植株在150μM百草枯处理条件下的生长情况

3.9.2百草枯处理对不同转基因植株质膜透性的影响

3.9.3百草枯处理对不同转基因植株叶绿素a荧光动力学的影响

3.9.4百草枯处理对不同转基因植株离体叶片的影响

3.10转基因植株的抗盐性分析

3.10.1转基因植株在200mM NaCl处理条件下的生长情况

3.10.2 200mM NaCl处理对不同转基因植株CAT活性的影响

3.10.3 200mM NaCl处理对不同转基因植株质膜透性的影响

3.10.4 200mM NaCl处理对不同转基因植株叶绿素含量的影响

3.10.5 200mM NaCl处理对不同转基因烟草渗透势的影响

3.10.6 200mM NaCl处理对不同转基因植株叶绿素a荧光动力学的影响

3.10.7 NaCl处理对不同转基因植株光和速率的影响

3.11转基因植株的抗高温分析

3.11.1转基因植株在高温处理下的生长情况

3.11.2高温胁迫对不同转基因植株叶片质膜透性的影响

3.11.3高温胁迫对不同转基因植株叶片叶绿素含量的影响

3.11.4高温胁迫对不同转基因植株叶绿素a荧光动力学的影响

3.11.5高温胁迫对不同转基因植株叶片光合速率的影响

3.12转基因植株的抗冷性分析

3.12.1转基因植株在低温处理后的生长情况

3.12.2低温处理不同转基因植株叶片质膜透性的影响

3.12.3低温处理不同转基因植株叶绿素含量的影响

3.12.4低温处理对不同转基因植株叶绿素a荧光动力的影响

3.12.5低温处理不同转基因植株光合速率的影响

4讨论

4.1多价基因转化的可能性

4.2同时转化AhBADH和PsCAT的可行性

4.3转基因植株的抗逆性分析

5结论

参考文献

致谢