转拟南芥系统获得抗性调节基因（NPR1）烟草的获得及其遗传分析

摘要

为了了解异源系统获得抗性调节基因在烟草中的表达是否能使烟草对广泛的病原菌具有较高的抗病性,以烟草叶盘作为转化受体,将拟南芥NPR1基因成功地导入了烟草K326和遵烟1号,转化率分别为27.3﹪、29.8﹪.烟草K326和遵烟1号各获得44株和9株经PCR和PCR-Southern杂交鉴定为阳性的转基因植株.通过自交获得了16株转基因K326的T<,0>代种子,对这些种子进行了卡那霉素（Km）抗生筛选并统计T<,1>代幼苗的Km抗性分离比,结果有9个株系的T<,1>代细苗对Km抗性按3：1分离.以NPR1基因引物对T<,1>代株系进行PCR鉴定,每个株系鉴定3株,除6株外其余都能扩增出目的片段.随机选取5个株系的PCR产物进行测序,结果表明所有PCR产物的序列均与拟南芥NPR1基因的对应序列完全一致.

目录

摘要

第一章前言

1.1转基因植物育种现状

1.2植物抗病性研究现状及进展

1.2.1抗病类型

1.2.2植物抗病机制

1.2.3植物抗病基因的克隆及应用

1.3植物系统获得抗性研究现状与进展

1.3.1植物系统获得抗病性概述

1.3.2 SAR的信号分子及传导途径

1.4拟南芥NPR1基因

1.5本研究目的与意义

第二章材料与方法

2.1菌株和质粒

2.2植物材料

2.3培养基及培养条件

2.3.1烟草基因转化用培养基配方

2.3.2细菌培养基

2.3.3培养条件

2.3.4菌种保存

2.4抗生素

2.5常用溶液及缓冲液

2.6转化方法与步骤

2.6.1抗生素浓度实验

2.6.2转化步骤

2.7转化效率实验

2.8 DNA的提取

2.8.1质粒DNA的提取

2.8.2烟草总DNA的提取

2.9 DNA的酶切、电泳及DNA片段浓度、大小测算

2.9.1 DNA酶切

2.9.2电泳及DNA片段浓度、大小测算

2.10 DNA片段的回收

2.11DNA-DNA杂交

2.11.1 Southern转移

2.11.2探针标记一随机引物标记

2.11.3 Southern杂交

2.12 PCR扩增DNA片段

2.13ABI DNA自动测序系统测定DNA序列

2.14T0代转化再生植株的种植

2.15烟草幼苗抗生素敏感实验

2.16转基因烟草幼苗抗生素抗性遗传分析

2.17T1代植株培育

第三章结果与分析

3.1烟草叶片组织对卡那霉素敏感性测定

3.2不同浓度的激素配比对烟草再生频率的影响

3.3叶盘侵染时间与菌液浓度对叶盘转化率的影响

3.3.1叶盘侵染时间对叶盘转化率的影响

3.3.2不同农杆菌菌液浓度对叶盘转化率的影响

3.4生根实验

3.5农杆菌介导烟草基因转化效率

3.6转基因烟草T0代分子鉴定

3.6.1转基因植株的PCR分析

3.6.2转基因植株的PCP—Southern Blotting杂交分析

3.7T0代植株农艺性状观察

3.8T1代烟草幼苗抗生素敏感试验

3.9转基因植株后代遗传分析

3.10T1代植株PCR分析

3.11T1代植株PCR产物测序

第四章讨论

4.1农杆菌介导的烟草转化

4.2转化外源基因的稳定性

4.3拟南芥NPR1基因利用

第五章小结

参考文献

致谢