植物NPR1及NPR1-like基因的克隆与功能分析

摘要

NPR1(nonexpressor of PR gene)基因可调控植物广谱抗性的发生，在植物系统抗性中起着关键作用。植物NPR1基因已成为植物抗病信号传导途径，以及植物抗病基因工程领域的研究热点。从不同植物中克隆NPR1基因及NPR1-like基因，并进行基因表达特点和抗病功能的研究，对于丰富NPR1里论基础和进一步在植物抗病基因工程中的应用都具有重要的意义。本文分别以棉花品种鲁棉22和心叶烟为材料，从棉花植株中首次克隆出1个NPR1同源基因(GhNPR1)，从心叶烟中首次克隆出2个NPR1同源基因(NgNPR1、NgNPR3)，在此基础上，分别对它们的表达特点及其抗病的生物学功能进行了分析。具体结果如下： 1.根据同源序列设计简并引物，通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从棉花(Gossypium hirsutum)中克隆到一个NPR1基因，命名为GhNPR1，GenBank注册号为EF988657。通过对其分子结构和氨基酸结构的对比分析，证明该基因为NPR1的同源基因。Southern杂交说明在棉花基因组中GhNPR1为单拷贝。Northern杂交发现GhNPR1在棉花中的表达不仅具有组织特异性而且还具有时间特异性。此外，植物抗病反应相关信号分子SA、MeJA、ET可以诱导GhNPR1的表达，同样给棉花接种棉花枯萎病菌和角斑病菌后，发现GhNPR1的表达量也逐步增加，进一步证表明GhNPR1可能参与了棉花抗病反应的基因表达调控。 2.从心叶烟(Nicotiana glutinosa)中同源克隆了NPR1基因，命名为NgNPR1，GenBank注册号为EU139477。利用同源序列对比及分析，证明该基因为NPR1的同源基因。并且通过NgNPR1-GFP亚细胞定位的研究，可以证明NgNPR1蛋白的结构特点与AtNPR1蛋白最为相近。RT-PCR检测NgNPR1表达特性时，发现NgNPR1基因可以被信号分子SA、MeJA、H2O2和INA诱导表达，而且细菌性病害青枯病和真菌病害烟草立枯病菌、黑茎病菌和赤星病菌接种心叶烟后，也可以不同程度的增加NgNPR1的表达量。这表明NgNPR1基因可能是SA依赖的信号转导途径的成员，参与心叶烟抗病反应的基因表达调控。 3.根据已知的NPR1及NPR1-like基因的同源序列，设计简并引物，通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从心叶烟(Nicotiana glutinosa)中克隆得到了一个坛NgNPR1-like基因，命名为NgNPR3，GenBank注册号为EF077161。同源对比分析发现，NgNPR3与拟南芥中AtNPR3同源性最高，且氨基酸结构中具有几个高度保守的典型序列结构。除此之外，NgNPR3基因组外显子-内含子结构位置的特征，也与已知的AtNPR3基因一致。因此推测NgNPR3基因是AtNPR3的同源基因。利用绿色荧光蛋白在洋葱表皮瞬时表达的实验，证明了NgNPR3蛋白可以通过SA、INA诱导而引起细胞内氧化还原电位势的变化，从细胞质运动到细胞核之中。Southern杂交说明在心叶烟基因组中坛NgNPR3为单拷贝。RT-PCR检测发现分别利用信号分子SA、MeJA、H2O2和INA诱导，以及接种青枯病、立枯病菌、黑茎病菌和赤星病菌后，NgNPR3在心叶烟中的表达量都会出现明显的增加，这意味着NgNPR3具有与NgNPR1基因相似的信号传导和调控体系。 4.将NgNPR3构建正义植物表达载体pBI121-NgNPR3，采用农杆菌介导的方法，转化烟草NC89，同时转空载体作为对照。经卡那霉素筛选获得若干再生植株。经过PCR鉴定，并选取部分转基因植株进行了Northern和Western杂交分析，结果证明NgNPR3在转基因烟草中已成功得到表达。并且转基因植株中存在三种不同的表达量，分别为高表达(H)、中表达(M)、低表达(L)。 5.选取具有代表性的三个T0代转基因株系(H、M、L)进行自交种子扩繁，得到T1代转基因植株。在分子鉴定基础上，对T1代转基因植株进行了生物学功能分析。抗真菌实验中，转基因植株在接种了烟草白粉病菌后，其抗病能力与坛NPR3基因的表达量成正比关系。即NgNPR3表达量高的植株(H、M)具有较高的抗性，低表达(L)植株与对照植株抗性很低。通过RT-PCR鉴定侵染后植株中PR基因的表达含量，证明高表达植株可以加快提高PR基因的表达，从而提高抗病能力。实验结果说明SAR诱导后NgNPR3基因也是诱导下游PR基因表达的重要调控因子。 6.构建原核表达载体pET-NgNPR3，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白，将特异诱导带切下，溶于PBS中获得抗原，免疫小鼠，制备抗体，从而对转基因植株进行Western杂交。

目录

论文说明：英文缩写符号及其中英文对照表

声明

摘要

第一章引言

1植物抗病基因工程的研究

1.1基因对基因假说

1.2过敏反应

1.3系统获得性抗性

1.4诱导系统抗性

2 NPR1基因的研究进展

2.1 NPR1基因的发现

2.2 NPR1在植物抗病性中的重要作用

2.3 NPR1的抗病机制

3本课题的研究意义及目的

第二章棉花GhNPR1的克隆与表达分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 GhNPR1基因的克隆

2.2 GhNPR1的序列分析

2.3 GhNPR1在棉花基因组中的拷贝数分析

2.4 GhNPR1的表达特性分析

3讨论

第三章 心叶烟NgNPR1基因的克隆与表达分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1NgNPR1基因的克隆

2.2NgNPR1的序列分析

2.3 NgNPR1亚细胞定位分析

2.4 NgNPR1的表达特性分析

3讨论

第四章心叶烟NgNPR3基因的克隆、表达与功能分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1NgNPR3基因的克隆

2.2NgNPR3的序列分析

2.3NgNPR3在棉花基因组中的拷贝数分析

2.4 NgNPR3瞬时核定位的研究

2.5NgNPR3的表达特性分析

2.6NgNPR3基因的原核诱导表达及抗体制备

2.7NgNPR3在烟草中的超表达及其转基因烟草的抗性鉴定

3讨论

小结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文