甜瓜14-3-3家族和NPR1-like基因克隆及功能分析

摘要

NPR1(nonexpressor of pathogenesis-related genes1)基因可参与植物的广谱抗性，在植物系统抗性中起着关键作用。14-3-3蛋白是一类普遍存在于真核生物中高度保守的调节蛋白，它通过与靶蛋白的相互作用，参与生物体内的基本代谢、信号转导、细胞分裂、光周期、生物胁迫、非生物胁迫等多种调控过程，是生物体内重要的调节蛋白。本文以甜瓜为材料，分别克隆了甜瓜NPR1-like基因和14-3-3家族全体成员，用qRT-PCR技术分析其在激素、生物逆境及非生物逆境下的表达模式，并通过在本氏烟中过表达CmNPR3和CmNPR4基因研究其与植物抗病性的关系。
　　甜瓜14-3-3家族和NPR1-like基因的克隆及亚细胞定位:利用RT-PCR技术克隆鉴定了来自甜瓜14-3-3家族的9个基因和2个NPR1-like基因（CmNPR3/CmNPR4），并对其进行了亚细胞定位。实验结果显示，14-3-3家族9个成员在细胞质和细胞膜上均有分布，而CmNPR3和CmNPR4蛋白则全部定位于细胞核中。
　　14-3-3家族成员、CmNPR3/CmNPR4的蛋白互作分析:分别将14-3-3家族基因构建到BiFC载体，通过农杆菌介导注射侵染本氏烟，激光共聚焦观察发现，该家族成员之间及其自身都能进行互作，形成同源或者异源二聚体。利用同样方法我们也对CmNPR3/CmNPR4进行互作验证，结果显示这两个蛋白自身以及之间也均能进行互作，并且不依赖于SA的诱导。这一结果在酵母双杂交实验中得到了进一步的验证。
　　14-3-3家族成员和CmNPR3/CmNPR4基因在非生物逆境和激素处理下表达模式分析:对甜瓜植株分别进行激素处理(SA/JA/ACC)和非生物逆境胁迫处理（冷、热、盐、干旱）。结果显示，在SA处理下，CmNPR3/CmNPR4基因表达明显上调，其余激素处理下基因表达变化不明显。干旱胁迫和热胁迫下14-3-3家族部分成员基因表达明显下调。
　　CmNPR3和CmNPR4基因正调控植物对病原菌抗性。通过农杆菌注射在本氏烟中瞬时表达CmNPR3和CmNPR4基因，两天后接种灰霉病菌（Botrytis cinerea）和Pst DC3000（Pseudomonas syringae pv.tomato），结果显示，接种Pst DC3000后，过表达CmNPR3和CmNPR4基因的植株与对照植物相比发病较轻，叶片上病斑较小，说明CmNPR3和CmNPR4基因在植株抵抗细菌侵染过程中有积极作用，而在接种灰霉病菌的实验中，过表达植株与对照组无明显区别。

目录

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致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 14-3-3蛋白的研究进展

1．1．1 14-3-3蛋白的发现与命名

1．1．2 植物14-3-3蛋白家族的结构和定位

1．1．3 植物14-3-3家族对植物生长发育的调控作用

1．1．4 植物14-3-3家族在非生物和生物胁迫下的作用

1．2 NPR家庭研究进展

1．2．1 NPR1在植物中的作用

1．2．2 NPR3和NPR4在植物中作用

1．2．3 NPR5和NPR6在植物中作用

第二章 材料与方法

2．1 植株材料和栽培条件

2．2 甜瓜总RNA的提取

2．3 cDNA的合成

2．4 甜瓜基因克隆鉴定

2．5 qRT-PCR表达分析

2．6 激素处理

2．7 干旱和盐害处理

2．8 冷胁迫和热胁迫处理

2．9 甜瓜各器官的采集

2．10 GFP过表达载体的建立

2．11 亚细胞定位

2．12 BiFC试验

2．13 酵母转化试验

2．14 酵母双杂交试验

2．15 灰霉菌的培养

2．16 灰霉菌接种试验

2．17 甜瓜枯萎病菌的培养及接种试验

2．18 引物列表

第三章 结果与分析

3．1 甜瓜14-3-3家族分析

3．1．1 甜瓜14-3-3家族成员鉴定

3．1．2 甜瓜14-3-3家族蛋白序列和进化树分析

3．1．3 甜瓜14-3-3家族成员亚细胞定位和异源二聚体分析

3．1．4 甜瓜14-3-3家族在甜瓜不同组织器官中表达模式分析

3．1．5 甜瓜14-3-3家族在枯萎菌侵染和激素处理下表达模式分析

3．1．6 甜瓜14-3-3家族在非生物逆境表达模式分析

3．2 甜瓜NPR1家族分析

3．2．1 甜瓜CmNPR3和CmNPR4克隆鉴定

3．2．2 甜瓜CmNPR3和CmNPR4蛋白序列分析

3．2．3 甜瓜CmNPR3，4亚细胞定位

3．2．4 甜瓜CmNPR3和CmNPR4酵母双杂交和BiFC互作分析

3．2．5 甜瓜CmNPR3和CmNPR4不同器官表达模式分析

3．2．6 甜瓜CmNPR3和CmNPR4在激素处理和枯萎病菌侵染下表达模式分析

3．2．7 在本氏烟中瞬时表达甜瓜CmNPR3和CmNPR4基因对病原菌抗性影响

第四章 讨论和小结

讨论与小结

参考文献