番茄中miR397靶基因LeLAC的克隆与表达分析

摘要

LAC(EC1.10.3.2)/漆酶是一类含铜的糖蛋白(多酚氧化酶)，存在于植物、真菌、昆虫和细菌等多种有机体中，在木质素合成、离子吸收和逆境响应等方面具有重要功能，并在转录后水平受多种microRNA的调控。 本研究在GenBank进行BLAST分析，获得了15个番茄LAC基因相关的EST片段，并对这些EST进行了同源比较和序列拼接，得到一个含有小分子RNAmiR397识别位点的LAC基因片段。然后，根据该片段的核苷酸序列信息进行5'-和3'-RACE扩增，得到了番茄LAC基因的全长cDNA(LeLACmiR397，登录号EU503151)。 氨基酸序列分析表明，LeLACmiR397蛋白与南芥AtLAC7和豌豆PsLAC同源性最高。蛋白质结构域推测表明，LeLACmiR397蛋白存在一个Cu-氧化酶结构域。LeLACmiR397基因的时空表达分析表明，该基因在根、花、成熟果实和愈伤组织中特异性表达，而在叶和茎中不表达。 鉴于小分子RNA miR397在不同植物中是高度保守的，为了检测miR397对LeLACmiR397基因的转录后调控，以拟南芥基因组DNA为模板，克隆了miR397α基因的前体序列，并构建了miR397α的表达载体，用农杆菌侵染法转化番茄子叶，获得了转基因番茄植株。表达分析表明，LeLACmiR397基因在非转基因番茄的成熟果实和根中表达，但在转基因番茄的果实和根中检测不到LeLACmiR397基因表达，所以，LeLACmiR397基因可能受miR397α的转录后调控，发生基因沉默。 LeLACmiR397基因编码多酚氧化酶，转基因番茄中多酚氧化酶活性分析表明，转基因植株的多酚氧化酶活性低于非转基因植株。盐胁迫下转基因番茄酶活性分析表明，转基因植株中三种抗性相关酶(超氧化物歧化酶SOD、多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD)的活性均低于非转基因植株，表明miR397对LeLACmiR397基因的转录后调控是植物抗逆性形成的负调控因素。

目录

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摘要

1引言

1.1 LAC基因的研究进展

1.1.1 LAC基因在植物中参与多种生理功能

1.1.2 LAC基因表达受microRNA介导的转录后调控作用

1.2植物miRNA的研究进展

1.2.1植物miRNA与其它生物miRNA的异同点

1.2.2植物miRNA的形成

1.2.3植物miRNA的作用机制

1.2.4植物miRNA的功能

1.3发现mIRNA及其靶基因的研究方法

1.3.1发现miRNA的研究方法

1.3.2发现miRNA靶基因的方法

1.4本研究的目的及意义

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株及质粒

2.1.3主要仪器设备

2.1.4 PCR引物

2.1.5主要化学试剂和试剂盒

2.2实验方法

2.2.1 CTAB法提取RNA

2.2.2 RNA含量和纯度检测

2.2.3第一链含有锚定引物的cDNA的合成

2.2.4 LAC cDNA克隆

2.2.5 PCR扩增产物的回收

2.2.6 PCR回收产物的克隆

2.2.7模板DNA的制备

2.2.8克隆载体的酶切鉴定

2.2.9序列测定及分析

2.2.10表达载体构建

2.2.11根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备与转化

2.2.12农杆菌介导的番茄转化

2.2.13逆境胁迫下转基因植株的生理生化测定

3结果与分析

3.1番茄中miR397靶基因LeLACmiR397片段的分子克隆

3.2 RT-PCR和RACE扩增获得LeLACmiR397的全长cDNA

3.3 LeLACmiR397基因的序列分析

3.3.1 LeLACmiR397基因的氨基酸同源性分析

3.3.2 LAC基因蛋白质结构域预测

3.4 LeLACmiR397基因的表达分析

3.5 LeLACmiR397基因受转录后水平调控

3.5.1拟南芥miR397a基因的克隆

3.5.2番茄植物表达载体的构建

3.5.3 pBI121-miR397a转基因番茄的获得

3.5.4转基因番茄中LeLACmiR397基因的转录后调控

3.6.LeLACmiR397基因沉默对逆境抗性的影响

3.6.1转基因植株酶活性的变化

3.6.2番茄LeLACmiR397基因与抗盐性分析

4讨论

4.1番茄LeLACmiR397的基因特征

4.2 miR397a对番茄LeLACmiR397基因转录后调控

4.3番茄LeLACmiR397基因的功能分析

5结论

参考文献

附录

致谢