山东省鸡肾型IBV的分离鉴定及其核蛋白基因的遗传变异分析

摘要

本研究在2006-2007年从山东省分离到10株肾型IBV，并通过电镜形态观察、致鸡胚矮小化试验、病毒干扰试验、血凝试验、动物回归试验以及分子生物学试验等方法对其进行了鉴定，同时对病毒基因组中的核蛋白基因序列进行了测定、分析和比较，以说明山东省肾型IBV毒株之间以及与参考毒株之间基因的遗传变异情况，同时构建系统进化树，分析山东省肾型IBV分离株与参考株之间的系统进化关系，探讨山东省肾型IB流行的背景和原因。 现地濒死病鸡病变组织处理后接种9～11日龄SPF鸡胚，接种鸡胚后72h内收集尿囊液，同时观察胚体病变。传3～7代后，发现死亡鸡胚表现出生长发育障碍(侏儒胚)，胚体弥漫性出血，尤其是头部出血比较明显，未死亡鸡胚呈现典型的卷曲胚。病毒尿囊液对鸡外周血红细胞无凝集活性。病毒尿囊液在电镜下表现为病毒粒子大多呈球形，直径约为80～120nm，有囊膜，表面有松散、均匀排列的冠状突起，呈现典型的冠状病毒特征，而且未发现有其它病毒粒子的存在。病毒干扰试验可见其能明显干扰NDV在鸡胚中的增殖。未经任何处理的10株分离株病毒对10mL/L的鸡红细胞无血凝活性，而经Ⅰ型磷脂酶C处理后10株分离株病毒对鸡红细胞具有血凝活性。从10株分离病毒的SPF鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，经RT-PCR扩增后将产物电泳，均获得了1600bp左右的核酸片段，与当初设计引物所要扩增的IBV基因片段大小一致，所以可以断定本研究所分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。回归动物后，均表现为肾肿胀、有尿酸盐沉积，形成“花斑肾”，因而确认从山东省分离到的这10株病毒为肾型IBV。 应用RT-PCR方法对从山东省分离鉴定到2006-2007年间的10株肾型IBV核蛋白基因序列进行了克隆、测定及分析，结果表明，这些毒株核蛋白基因的核苷酸序列由1230bp组成，编码由409个氨基酸残基组成的多肽，与Beaudette株相应区域基因序列长度一致。10株肾型IBV分离毒株之间相比，N基因核苷酸及推导氨基酸的同源性分别为84.6％～99.7％和86.6％～99.8％，与参考毒株N基因核苷酸及推导氨基酸的同源性分别为84.1％～98.9％和86.1％～98.5％。进行序列比较后发现，山东省大部分肾型IBV分离株的核蛋白基因的核苷酸序列存在广泛的基因突变现象，这可能是造成山东省肾型IBV分离株基因组发生变异的主要原因之一。 根据本研究从山东省分离鉴定到2006-2007年间的10株肾型IBV病毒与我国其他IBV分离株、我国常用疫苗株以及国外参考毒株绘制的系统进化树发现，从山东省分离到10株肾型IBV具有两个大的基因进化群。SD0605和SD0608属于基因Ⅰ型，其中主要是Mass血清型毒株，包括美国、荷兰、澳大利亚、日本等国家的IBV代表性毒株以及国内的。肾型IBV代表毒株。SD0605N基因与中国广东IBV肾型疫苗株D41以及H120同源性最高，核苷酸及推导氨基酸同源性均分别为98.9％和98.5％；SD0608N基因与中国广西肾型毒株GX2的同源性最高，核苷酸及推导氨基酸同源性分别为94.9％和95.6％。这提示SD0605和SD0608的存在可能与山东省长期使用弱毒疫苗有关，存在基因重组现象。其余的八株分离株病毒属于基因Ⅱ型，其中主要是广东肾型IBV毒株GDS14和新疆肾型IBV毒株LX4，以及山东的IBV分离株QXIBV，与我国常用弱毒疫苗株如H120、H52等关系较远。以上结果说明山东省肾型IBV毒株与我国其他地方的肾型IBV毒株关系比较近，现有的疫苗可以对部分毒株起到一定的预防作用，但对于SD0702这种变异如此大的毒株可能很难有效预防，有必要继续跟踪研究山东省的肾型IBV流行情况，并在此基础上进行新型疫苗的研制和制定有效的肾型IBV防控措施。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

引言

1鸡传染性支气管炎概述

2鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学研究进展

2.1鸡传染性支气管炎病毒生物学分类地位

2.2鸡传染性支气管炎病毒粒子结构及基因组

2.3鸡传染性支气管炎病毒的主要结构蛋白及其复制

3鸡传染性支气管炎流行病学研究概况

3.1鸡传染性支气管炎病毒的分子变异

3.2鸡传染性支气管炎国内外的流行情况

4研究目的和意义

试验一10株鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1IBV的形态学观察

2.2致鸡胚矮小化试验

2.3病毒干扰试验

2.4血凝试验

2.5半数鸡胚感染量(EID50)测定结果

2.6动物回归试验

2.7N基因的扩增及电泳结果

3.结论与讨论

试验二鸡肾型IBV山东分离株核蛋白基因的遗传变异分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1IBV各分离毒株N基因的序列确定

2.2IBV分离株N基因序列比较分析

2.3IBV分离株N基因序列同源性

2.4N蛋白3个保守碱性氨基酸区的序列分析

2.5IBV分离株N基因核苷酸及其推导的氨基酸系统进化树分析

3.讨论

结论

参考文献

附录

致谢

个人简介及攻读学位期间发表论文情况