海南岛橡胶根际嗜铁细菌B.subtilis CAS15筛选及嗜铁素基因dhbC克隆、表达与功能分析

摘要

铁是一切生命体不可或缺的必需元素，尽管其含量丰富，但由于在中性pH氧化条件下铁离子可溶性很低，常常成为限制生命体生长的营养元素。因此，许多微生物合成具有螯合铁离子能力的嗜铁素以获取所需要的铁离子。嗜铁微生物可通过分泌嗜铁素提高环境中铁的生物有效性，从而促进植物的生长，还可通过与病原微生物竞争环境中有限的铁离子，达到控制植物病害的目的。在缺铁条件下，枯草芽孢杆菌可分泌儿茶酚型嗜铁素bacillibactin(BB)以获取所需要的铁离子。 本研究首次通过CAS(Chrome Azurol Sulphonate)检测平板法从海南岛橡胶树根际土壤分离获得一批嗜铁细菌，并以在CAS检测平板上产生较大橘黄色晕圈的拮抗细菌枯草芽孢杆菌CAS15为研究对象，克隆了B.subtilis嗜铁素基因dhbC并实现了在大肠杆菌中的表达，并通过同源重组法构建dhbC基因缺失突变株和回复株，验证了dhbC基因的功能，证明了dhbC基因在B.subtilis嗜铁素生物合成中发挥重要作用。该论文的研究结果为嗜铁微生物的筛选利用及其生防机理的研究奠定了基础，为植物病害的生物防治提供了新的思路。主要研究结果和结论如下： 1.根据菌株的形态特征和生理生化特性，将CAS15初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)；16S rDNA序列分析显示，CAS15的16S rDNA与枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis16S rDNA序列具有99.4％的同源性，在所构建的系统进化树上，CAS15与枯草芽孢杆菌(登录号为DQ207730和EU047884)及芽孢杆菌(登录号为ABl18212)的遗传距离最近，处在同一分支，因此，将CAS15鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 2.通过电喷雾离子化质谱分析(Electrospray Ionization Mass Spectrometry，ESI-MS)研究了CAS15分泌的嗜铁素，结果表明，CAS15提取物在m/z881.2([M-H]1-)处的质谱峰值与3H2O(DHB-Gly-Thr)3的峰值一致，其准确分子质量为881.25；通过DHB(G)分析，研究了铁离子对CAS15嗜铁素产量的影响，发现铁离子抑制嗜铁素的产生，而且，培养基中FeCl3浓度越高，对嗜铁素产生的抑制作用越强。当培养基中不含FeCl3时，其OD510/OD600值为0.10～0.39；当培养基中含有5/μmol/L FeCl3时，其OD510/OD600值为0.005～0.04；而当培养基中含有50μmol/L FeCl3时，其OD510/OD600值仅为0.001～0.01。 3.对CAS15嗜铁素分泌影响因素进行了研究，结果表明，改良MM培养基为CAS15嗜铁素分泌的最适培养基，以葡萄糖为碳源，以色氨酸为外源氨基酸，pH7.2，37℃条件下培养，有利于CAS15分泌嗜铁素，可获得较高产量的嗜铁素。 4.通过室内平板对峙试验研究了CAS15对15个常见病原菌的拮抗作用，结果显示，CAS15对这15个常见病原菌有较强的拮抗作用，拮抗带宽带为6～10 mm；并研究了CAS15菌液过滤液对15个病原菌的抑制作用，结果显示，抑制率为20.18％～94.07％，表明，CAS15具有较强较广泛的拮抗谱。 5.黄瓜种子发芽试验结果表明，100倍液和1000倍液能有效促进芽的生长，其中100倍液效果最好。离体叶片接种试验结果显示，CAS15菌悬液对芒果炭疽病具有较强的抑制作用，病情指数下降了53.34％，防效达到78.95％，表明CAS15具有较好的促进植物生长及生物防治潜能。 6.根据已报道的枯草芽孢杆菌基因组序列，设计特异性引物，通过PCR扩增，获得了CAS15 dhbC基因片段，该片段长1197 bp，预期编码398个氨基酸残基的多肽。BLASTn搜索结果显示，该基因片段与B.subtilis subsp.subtilis str.168和Bacillus subtilissubsp.subtilis str.NCIB3610的dhbC基因序列(accession No.Z99120.2和NZ ABQL01000005.1)分别具有99.74％和99.58％同源性，在核苷酸序列上，分别只有4个和5个碱基不同，在氨基酸序列上，分别有2个和3个氨基酸残基不同。 7.通过网络工具http：//www.expasy.org/对CAS15 dhbC基因编码产物DhbC进行结构分析与预测，结果显示：CAS15 dhbC基因编码产物的等电点为5.30，为酸性蛋白质，稳定系数为53.00，表明该蛋白质性质不稳定；总平均疏水指数(Grand average ofhydropathicity，GRAVY)为-0.303；DhbC蛋白含有带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)57个，带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)39个，总原子数为6098，其分子式为C1910H3039N545O592S12；DhbC蛋白含有5个蛋白激酶C-磷酸化位点；含有6个酪蛋白激酶II磷酸化位点，1个酪氨酸激酶磷酸化位点及2个N-豆蔻酰化位点；由于其蛋白结构的不稳定性，DhbC有可能由氨基酸14-394，122-397，69-393各形成一种三级结构模型。 8.将CAS15 dhbC基因片段连接到表达载体pET-30a(+)，并经氯化钙转化法导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a-dhbC，以1 mmol/L的IPTG进行诱导，经30℃诱导4 h后实现了高效表达，获得了48.8 kDa的融合蛋白，表达产物主要以可溶形式存在，重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的58％。由于所采用的pET-30a(+)表达系统所表达的蛋白质带有6个连续的组氨酸，可以通过Ni2+金属亲和层析进行重组蛋白的纯化并通过Western blot进行分析，结果表明，重组蛋白可与兔抗His-tag多克隆抗体发生特异性反应。 9.通过同源重组法，将CAS15基因组中dhbC基因敲除，获得了dhbC基因缺失突变株，并将dhbC基因重新导入CAS15 dhbC基因缺失突变株，获得CAS15 dhbC基因回复株，经CAS检测平板检测，回复株能够和原CAS15菌株一样，在检测平板上产生明显的橘黄色晕圈，而CAS15 dhbC基因缺失突变株不能，表明dhbC基因与嗜铁素的产生密切相关，验证了dhbC基因在B.subtilis isochorismate生物合成过程中的重要性，说明dhbC基因在CAS15嗜铁素生物合成中发挥重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词及中文对照表

声明

第一章文献综述

1植物根系吸收铁的机制

1.1机理Ⅰ

1.2机理Ⅱ

2植物缺铁适应性及其调控

2.1植物缺铁适应性

2.2植物缺铁适应性的调控

3土壤微生物改善植物铁营养

3.1根际微生物通过分泌嗜铁素，增加土壤中铁的生物有效性

3.2土壤微生物与植物的共生作用，改善植物的铁营养状况

4嗜铁菌的筛选

4.1嗜铁素在促进植物生长方面的作用

4.1嗜铁素在植物病害防治方面的作用

4.3常用的嗜铁素检测方法

4.4嗜铁素拮抗菌的筛选

5嗜铁素相关基因研究进展

5.1生物合成相关基因

5.2调控基因

6基因功能研究进展

6.1基因的生物信息学分析

6.2基因的时空表达谱分析

6.3基因的功能预测

6.4基因功能的实验学验证

7本研究的目的意义和研究内容

7.1目的意义

7.2研究内容

第二章嗜铁细菌枯草芽孢杆菌CAS15的分离鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1产嗜铁素细菌的筛选

2.2 CAS15的种类鉴定

2.3嗜铁素的质谱分析

2.4.DHB(G)分析

2.5 CAS15嗜铁素分泌影响因素

3讨论

第三章 CAS15生防效果初步评价

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1室内平板对峙试验

2.2培养液过滤液的抑制作用

2.3对芒果炭疽病的抑制作用

2.4 CAS15菌液过滤液对黄瓜种子发芽率及芽长的影响

3 讨论

第四章CAS15 dhbC基因的克隆及序列分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 CAS15 dhbC基因的克隆与序列分析

2.2 DhbC的结构预测

3讨论

第五章CAS15 dhbC基因的原核表达

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1表达载体的构建与工程菌的筛选

2.3 dhbC基因在大肠杆菌中的表达

2.4最佳诱导温度分析

2.5重组蛋白DhbC可溶性分析

2.6表达产物的纯化

2.7重组蛋白DhbC Western blot分析

3讨论

第六章B.subtilis CAS15嗜铁素基因dhbC功能验证

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 neo'DNA片段的获得

2.2 dhbC基因的敲除和缺失突变株的获得

2.3 dhbC基因的重新导入和回复株的PCR鉴定

2.4回复株的斑点杂交检测

2.5 dhbC基因功能验证

3讨论

结论与展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况