嗜铁菌CAS19产嗜铁素条件及其嗜铁素合成相关基因cepR的克隆与分析

摘要

本研究以嗜铁细菌洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19为出发菌株,对其产嗜铁素的条件、嗜铁素检测平板的比较、拮抗谱、对番茄和黄瓜的促生效果以及嗜铁素合成相关基因cepR的克隆和生物信息分析进行了初步研究。结果如下:
　　 1.采用光谱吸收法,对CAS19产嗜铁素的条件进行了研究。结果表明,MSA培养基最适于CAS19产嗜铁素,并且在320nm处有一个嗜铁素特异吸收峰;当铁离子浓度大于1μmol/L时,几乎完全抑制CAS19嗜铁素的产生;CAS19产嗜铁素的最适条件为:以蔗糖为C源,以脯氨酸为N源,C/N为10:1,pH值为7.5,温度为30℃,通气量是20/250(mL)。
　　 2.通过比较两株洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19和CAS17在两种检测平板上的嗜铁圈大小,发现MSA-CAS蓝色检测平板上的嗜铁圈明显大于通用CAS检测平板,表明MSA-CAS蓝色检测平板更适合洋葱伯克霍尔德氏菌嗜铁素的检测。
　　 3.将CAS19菌株与20株靶标病原真菌进行室内平板对峙培养,实验结果表明,CAS19对其中的13个病原菌有拮抗作用,产生了明显的抑菌带,说明CAS19对常见病原菌有较广泛的拮抗作用。
　　 4.用CAS19菌液稀释100倍液定期浇灌黄瓜幼苗,处理的株高、茎围和鲜重均明显高于清水对照处理和空白MSA对照处理,可见它对黄瓜幼苗生长有十分显著的促进作用。
　　 5.番茄种子发芽实验结果表明,CAS19、CAS5、CAS12、CAS17、CAS15这5株嗜铁细菌对于番茄种子的发芽都有明显的促进作用,除CAS15是振荡培养24小时后稀释1000倍液效果好外,其它4种菌液都是稀释100倍的效果最好,可能是由于MSA培养基比较适合伯克霍尔德式菌产嗜铁素,而不太适合枯草芽孢杆菌CAS15,其稀释倍数大反而有利于发芽。清水对照平均芽长略高于空白MSA对照,但差异不大。
　　 6.研究CAS19、CAS5、CAS12、CAS17、CAS15这5株嗜铁细菌的菌液、上清液和菌体悬浮液对番茄生长的影响,结果发现菌体悬浮液对番茄生长几乎没有影响,而菌液和上清液的效果却十分明显,说明对番茄植株起促生作用的不是菌体本身,而是它的分泌物,可以推断嗜铁细菌分泌的嗜铁素有利于番茄植株生长。通过综合株高、根长、茎围、重量等几项测量数据,在这5种嗜铁细菌中,以CAS19和CAS17的促生效果最好。
　　 7.采用PCR方法克隆了CAS19嗜铁素合成相关基因cepR,并对cepR基因编码蛋白的结构和功能进行生物信息学分析和预测。研究结果表明,cepR基因全长768 bp,包含一个完整的231 bp的开放阅读框架,编码239个氨基酸:同源性分析表明其核苷酸序列与Burkholderia cepacia LMG1222 cepR基因的同源性为99％;该基因编码蛋白分子量为26.59 KD,理论等电点为5.55,含有一个LuxR型HTH结构域,在氨基酸残基的不同区域分布有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点和N-糖基化位点,还有一个明显的跨膜结构。本研究结果将为洋葱伯克霍尔德氏菌嗜铁素合成相关研究提供调控基因信息和参考依据,并为其进一步开发和利用奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 铁的生理机能和铁的生物有效性

1.2 嗜铁素的概念及分类

1.3 嗜铁素的检测方法

1.3.1 Aronw试验和Cscky试验

1.3.2 通用CAS检测法

1.3.3 400nm特异光吸收法

1.3.4 630nm处的相对吸光度法

1.4 嗜铁菌在植物病害防治方面以及促进生长方面的应用

1.4.1 植物根际促生菌

1.4.2 嗜铁菌在植物病害防治方面的应用

1.4.3 嗜铁菌在促进植物生长方面的应用

1.5 洋葱伯克霍尔德氏菌群(Bcc)

1.5.1 洋葱伯克霍尔德氏菌概述

1.5.2 洋葱伯克霍尔德氏菌群的生防及促生作用机制

1.5.3 洋葱伯克霍尔德氏菌的应用

1.6 嗜铁素合成相关基因的研究

1.6.1 ent基因

1.6.2 PVD基因

1.6.3 pch基因

1.6.4 fur基因

1.6.5 cepR基因

1.6.6 dhbC基因

1.7 生物信息学概述

1.8 本研究的目的意义和研究内容

1.8.1 目的意义

1.8.2 研究内容

第二章 洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19产嗜铁素的条件研究及两种嗜铁素检测平板的比较

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 铁离子对CAS19产嗜铁素的影响

2.2.2 影响CAS 19产嗜铁素的条件研究

2.2.3 两种嗜铁素检测平板的比较

2.3 讨论

第三章 几株嗜铁细菌的生防效果研究

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 CAS19的拮抗谱

3.2.2 嗜铁细菌的促生作用

3.3 讨论

第四章 CAS19嗜铁素合成相关基因cepR的克隆及生物信息分析

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果与分析

4.2.1 cepR基因的克隆

4.2.2 cepR基因的同源性分析

4.2.3 cepR基因编码蛋白的一级结构分析

4.2.4 cepR基因编码蛋白的二级结构分析

4.2.5 cepR基因编码蛋白的三级结构分析

4.3 讨论

结论

研究展望

参考文献

发表相关的论文

致谢

附图 种植40天后番茄植株生长状况