山东主要草莓种植区草莓枯萎病菌抗药性及抗三唑酮菌系的生理生化研究

摘要

本研究从山东招远、滕州、泰安和临沂大棚草莓种植区采集分离了12个草莓枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.fragariae)菌株，采用生长速率法测定了12菌株对6种三唑类药剂和4种其它类药剂的抗性，并分别比较了12个菌株对这些药剂的抗性水平。从采集的菌株中筛选出一株对三唑酮敏感且生长势强，气生菌丝旺盛的菌株(ZY001)为供试亲本敏感菌株，室内经药剂筛选获得了抗三唑酮草莓枯萎病菌菌株(ZYK)，另选出1株对三唑酮高抗性的菌株作为田间抗性菌株。研究了草莓枯萎病菌对三唑酮的抗性发展规律；测定了不同地区草莓枯萎病菌菌株对几种常用药剂的抗性水平，并测定了抗三唑酮菌系对这些药剂的交互抗性。比较了抗三唑酮菌系和敏感菌系间的生理生化差异。研究结果表明： 1.戊唑醇、烯唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑、腈菌唑、三唑酮、福美双、恶霉灵、甲基硫菌灵和多菌灵对12个菌株的EC50值分别分布在0.1107～1.1670、0.1446～2.2586、0.1307～9.0317、0.1623～9.5898、1.1969～60.927、0.8831～162.81、202.99～852.90、9.3728～76.517、10.026～99.777和1.3335～4.1616μg/mL之间。12个草莓枯萎病菌对三唑酮和丙环唑的抗性均有66.7％的菌株对三唑酮和41.7％的菌株对丙环唑的抗性倍数大于10，抗性水平较高；同时，对苯醚甲环唑、腈菌唑、戊唑醇和烯唑醇也均出现了抗性倍数大于10的菌株，说明三唑类药剂防治草莓枯萎病存在一定的抗性风险。另外，10种药剂对12个菌株总体的毒力测定表明，戊唑醇和烯唑醇对草莓枯萎病菌的毒力高，可作为多菌灵的轮换或替代药剂使用。 2.通过采用药剂连续诱导法获得抗性菌株ZYK，其对三唑酮的EC50值为14.662μg/mL，与敏感菌株ZY001比较，抗性倍数为16.60倍；经UV多次诱导均未获得抗性菌株；田间抗性菌株TA002的EC50值为162.81μg/mL。通过对各抗性菌系进行抗性稳定性测定，发现各菌系在无药培养基上连续转移8代后，诱导抗性菌系的EC50值波动范围很小，稳定性较强，而田间抗性菌株TA002的EC50值有降低趋势，转移10代后，其抗性衰减了一半。 3.用诱导获得的抗性菌株ZYK进行交互抗性试验，根据其结果可初步判定三唑酮与戊唑醇、烯唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑和腈菌唑之间存在交互抗性，而与多菌灵、甲基硫菌灵和恶霉灵不存在交互抗性，与福美双存在负交互抗性现象。 4.以获得的抗性菌株和敏感菌株为材料，研究了抗性菌株和敏感菌株之间生理适合度的差异。发现敏感菌株ZY001的致病力强于诱导抗性菌株ZYK的致病力；供试的3菌株对碳源要求均不严，对氮源利用的差异较大，所有菌株均在含硝酸盐的培养基中生长最快，但对铵盐(NH4)2SO4和(NH4)2Cl的利用能力很差。所有供试菌株均在25℃和28℃时生长速度最快，在5℃和35℃条件下几乎停止生长；在相同的温度条件下，诱导抗性菌株ZYK的直径相对要低于敏感菌株ZY001。所有供试菌株在pH值6、7、8、9时均生长较快，在pH值≥9时，各菌株菌丝生长稀薄，气生菌丝较少；而在酸性条件下各菌株的气生菌丝生长与在中性条件下无差别。 5.三唑酮能对草莓枯萎病菌的细胞膜造成伤害，使敏感菌株ZY001的细胞膜透性不断上升；诱导抗性菌株ZYK和田间抗性菌株TA002适应三唑酮的能力明显高于敏感菌株，其细胞膜受伤害的程度相对较低，且这种适应能力随着三唑酮浓度的提高而减弱。 6.不同浓度三唑酮处理后的各抗性与敏感菌株，体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)的活性随时间而变化，且活性与抗药性呈一定的相关性。用药剂处理后PAL活性表现出先迅速上升又迅速下降的趋势，以25μg/mL处理3h时TA002活性最高，达613U/g·h；ZYK和ZY001的PAL活性值也分别为593和409U/g·h；此后所有处理的PAL活性随着时间迅速下降。用三唑酮处理所有菌株，24h内所有菌株的POD活性不断升高，抗性菌株的POD活性明显高于敏感菌株，其中TA002的活性最高；至24h，用25μg/mL三唑酮处理后TA002、ZYK和ZY001的POD活性分别为32.05、22.54和18.86U/g·min，均达最高值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

1引言

1.1植物枯萎病的发生与危害

1.1.1尖孢镰刀菌的分类地位

1.1.2尖孢镰刀菌的寄主范围

1.1.3尖孢镰刀菌的专化型和生理小种

1.1.4危害症状

1.1.5尖孢镰刀菌的生物学特性

1.1.6病害循环

1.1.7枯萎病的防治

1.2草莓枯萎病概况

1.2.1发生情况及防治研究

1.2.2发病症状及发病规律

1.2.3草莓枯萎病的综合防治

1.3三唑类杀菌剂概述

1.3.1三唑类杀菌剂的开发及应用现状

1.3.2三唑类杀菌剂的作用机制

1.3.3三唑类杀菌剂的抗药性

1.3.4存在的问题及展望

1.4立题依据与研究意义

2材料与方法

2.1供试药剂、试剂

2.1.1供试药剂

2.1.2化学试剂

2.2仪器设备

2.3供试菌株

2.4草莓枯萎病菌的采集、分离纯化、鉴定及保存

2.4.1草莓枯萎病菌标样的采集

2.4.2草莓枯萎病菌的分离与纯化

2.4.3分离菌的回接

2.4.4病原菌的鉴定

2.4.5草莓枯萎病菌的保存

2.5培养基的配制（方中达，1998）

2.5.1 PDA培养基

2.5.2选择性PDA培养基

2.5.3含药PDA培养基

2.5.4查彼克（Cazapek固体培养基)

2.5.5土豆斜面(即马铃薯斜面)

2.6草莓枯萎病菌对10种药剂的抗性水平测定

2.7草莓枯萎病菌抗药性菌系的选育方法

2.7.1药剂连续选择

2.7.2紫外诱变

2.8抗性菌系遗传稳定性测定

2.9抗性菌系的交互抗药性测定

2.10抗性菌系生理生化研究方法

2.10.1各菌系对渗透压敏感性测定

2.10.2三唑酮对各菌系菌株细胞膜透性的影响测定

2.10.3抗性菌株和敏感菌株苯丙氨酸解氨酶活力测定

2.10.4抗性菌株和敏感菌株过氧化物酶活力测定

2.11不同菌系的生物学特性

2.11.1抗性菌系的致病性

2.11.2 pH值对各菌系生长的影响

2.11.3温度对各菌系生长的影响

2.11.4光照条件对各菌系生长的影响

2.11.5 8种碳源和8种氮源对各菌系生长的影响

3结果与分析

3.1病原菌鉴定

3.2山东草莓主产区草莓枯萎病菌对10种杀菌剂的抗性

3.2.1草莓枯萎病菌对三唑酮的抗性比较

3.2.2草莓枯萎病菌对丙环唑的抗性差异比较

3.2.3草莓枯萎病菌对苯醚甲环唑的抗性差异比较

3.2.4草莓枯萎病菌对腈菌唑的抗性差异比较

3.2.5草莓枯萎病菌对烯唑醇的抗性差异比较

3.2.6草莓枯萎病菌对戊唑醇的抗性差异比较

3.2.7草莓枯萎病菌对多菌灵的抗性比较

3.2.8草莓枯萎病菌对甲基硫菌灵的抗性差异比较

3.2.9草莓枯萎病菌对福美双的抗性差异比较

3.2.10草莓枯萎病菌对恶霉灵的抗性比较

3.2.11 10种杀菌剂对草莓枯萎病菌的毒力比较

3.3抗性菌株的诱导选育

3.3.1药剂选择下草莓枯萎病菌对三唑酮的抗性发展规律

3.3.2紫外诱变

3.3.3田间抗性菌株

3.4抗药性稳定性

3.5抗性菌系的交互抗药性

3.5.1抗三唑酮草莓枯萎病菌系对9种药剂的交互抗性

3.6抗性菌系的生理生化研究

3.6.1各菌系对渗透压的敏感性的影响

3.6.2三唑酮对各菌系菌株细胞膜透性的影响

3.6.3抗性菌株和敏感菌株苯丙氨酸解氨酶活力测定

3.6.4抗性菌株和敏感菌株过氧化物酶活力测定

3.7不同菌系的离体适合度测定

3.7.1诱导抗性菌株的致病性

3.7.2各抗性菌系与敏感菌系的菌丝生长速率比较

3.7.3碳源对不同菌系菌落直径的影响

3.7.4氮源对不同菌系菌落直径的影响

3.7.5温度对不同菌系菌落生长的影响

3.7.6 pH对不同菌系菌落生长的影响

3.7.7光照对不同菌系菌落生长的影响

4讨论

4.1 山东主要草莓种植区草莓枯萎病菌对10种药剂的抗性水平

4.2草莓枯萎病菌对三唑酮的抗性发展规律

4.3草莓枯萎病菌对三唑酮的抗性机理

4.3.1草莓枯萎病菌的渗透压敏感性及相对渗率变化

4.3.2三唑酮诱导草莓枯萎病菌体内酶活变化

4.4关于草莓枯萎病菌抗性菌系的生理适合度

5结论

6本论文的创新之处

7参考文献

8致谢

9攻读硕士期间发表论文情况