鸭副粘病毒分离鉴定、F基因序列分析及生物学特性研究

摘要

鸭副粘病毒病(Duck Paramyxo Virus Disease)是由鸭副粘病毒(DuckParamyxo Virus)引起的一种病毒性急性传染病。该病以气管环出血，肺脏弥漫性出血，脾脏肿大为主要特征。鸭副粘病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亚科，腮腺炎病毒属(Rubulavirus)。长期以来，禽1型副粘病毒不感染水禽，水禽即使带毒也不发病。但近年来，该病的流行又呈现出新的特点：高抗体禽群发生该病，禽l型副粘病毒对水禽的致病力逐渐增强，水禽(鹅、鸭、企鹅等)不再仅是禽1型副粘病毒的宿主和储存库，已成为禽1型副粘病毒的易感禽类。其中鹅、鸭的易感性最高，且不同同龄的鹅、鸭均易感，日龄越小，发病率和死亡率越高，半个月内的雏鸭、雏鹅发病率和死亡率最高。近年来，该病在我国呈上升趋势，给我国养鸭业乃至整个养禽业带来巨大的经济损失。 2006-2008年在山东地区部分养鸭场出现鸭子大量死亡现象，本实验室从来自潍坊、滨州、肥城、东营、泰安、济南的鸭病料和鸭胚中分离得到六株鸭副粘病毒。应用RT-PCR技术对这六株副粘病毒的F基因扩增后进行序列测定，并与传统疫苗株、标准强毒株F48E9和已发表的24株鸭副粘病毒进行同源性比较、进化树分析，旨在从分子生物学水平阐明山东地区鸭副粘病毒分离株之间的亲缘关系以及与其它地区流行株之间的亲缘关系，为该病的预防和控制提供理论依据。 本课题分二部分进行研究。 第一部分：一株经鸭胚传递的鸭副粘病毒的分离鉴定及生物学特性研究 2008年6月份山东省某种鸭场260同龄的种鸭出现产蛋下降，但未出现死亡，该种鸭群所产种蛋连续3批在孵化至20～25胚龄时出现约10％的死胚，出壳后雏鸭弱雏较多，部分雏鸭出壳后即出现神经症状，表现为头颈扭转、角弓反张、斜颈、左右摇摆、站立不稳、瘫痪等，剖检可见脑膜出血、肺脏出血、十二指肠黏膜弥漫性出血。为确定发病原因，我们对死亡鸭胚、1日龄的病死鸭及出现神经症状的雏鸭进行了病原的分离、鉴定，确定为副粘病毒，命名为SDFCH株，对该分离株的生物学特性进行了研究。毒力测定结果表明该病毒鸡胚平均致死亡时间(MDT)为56.6 h；1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数(ICPI)为1.78；6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.59。攻毒雏鸭生长缓慢，精神沉郁，剖检可见气管弥漫性出血、肺脏出血、腺胃乳头出血、胰脏出血、十二指肠黏膜弥漫性出血，个别雏鸭脑膜出。 第二部分：鸭副粘病毒山东株F基因克隆与序列分析 对2006-2008年从山东省不同地区规模化鸭场采集的疑似鸭副粘病毒病症状的病料进行了鸭副粘病毒的分离鉴定及F基因克隆和序列分析，结果表明F基因的核苷酸序列较稳定，不同地区6株鸭副粘病毒毒株的F基因全基因组序列均由1662bp组成，彼此间核苷酸序列同源性达95.3％～99.8％，亲缘关系密切；与Genbank已发表的鸭副粘病毒参考毒株的同源性介于87.4％～97.8％；与Genbank已发表的鹅副粘病毒参考毒株的同源性介于95.7～98.4％；与传统的疫苗株Lasota株的同源性在87.7％～88.3％之间；与F48E9的同源性在90.3％～91.0％之间。系统进化树分析表明这6株毒株与江苏、黑龙江、广东的鹅副粘病毒毒株和鸭副粘病毒毒株亲缘性较近，属于同一分支。本研究对所测定的6株鸭副粘病毒毒株F基因所对应的氨基酸序列分析表明：6株毒株之间的氨基酸同源性为95.3％～98.0％；与Genbank已发表的鸭源副粘病毒的氨基酸同源性为87.4％～97.5％；与鹅源副粘病毒的氨基酸同源性为96.4％～98.4％：与传统的疫苗株Lasota株的氨基酸同源性为87.9％～88.3％；与F48E9的氨基酸同源性为90.1％～91.0％。6株毒株与鹅源副粘病毒的亲缘性较近，因此推测鸭副粘病毒是由鹅源副粘病毒进化而来。

目录

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引言

1鸭副粘病毒概述

1.1流行病学

1.2临床症状及病理变化

2病原学研究

3分子生物学研究

3.1融合蛋白(F蛋白)

3.2 HN蛋白

3.3 M蛋白

3.4 NP蛋白

3.5 P蛋白

3.6 L蛋白

4 鸭副粘病毒检测方法的研究

4.1病毒的分离与鉴定

4.2血凝、血凝抑制试验

4.3荧光抗体技术

4.4酶联免疫吸附试验

4.5 RT-PCR技术

4.6核酸探针检测技术

5鸭副粘病毒的预防与控制

5.1活疫苗

5.2灭活苗

5.3亚单位疫苗

5.4核酸疫苗

5.5重组活载体疫苗

6研究的目的与意义

试验一 一株经鸭胚传递的鸭副粘病毒的分离鉴定及生物学特性研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1病毒分离、增殖与鉴定

2.2生物学毒力指标测定结果

2.3鸭胚半数致死量测定

2.4动物回归试验

2.5 F基因RT-PCR扩增

2.6扩增产物克隆与鉴定

2.7序列分析

3讨论

实验二六株鸭副粘病毒株F基因的克隆及序列分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 RT-PCR

2.2重组质粒的酶切鉴定结果

2.3测序结果及序列分析

3讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况