鸭圆环病毒核酸探针检测方法的建立及Cap蛋白核定位信号的研究

摘要

鸭圆环病毒（DuCV）是圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）的新成员。DuCV感染可导致鸭子羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻等症状。本研究建立了核酸探针检测鸭圆环病毒的方法，并用此方法对鸭圆环病毒的流行病学进行了调查，同时借助杆状病毒-昆虫细胞表达系统对DuCV Cap基因进行表达并对其核定位信号进行了研究。
　　 以DuCV传染性克隆为模板制备了检测DuCV的核酸探针，研究表明该探针特异性强，只能与DuCV核酸发生特异性杂交，而与对照的鸭病毒性肝炎Ⅰ型(DHV-1)病毒、鸭瘟病毒(DPV)的核酸杂交反应为阴性；灵敏度高，最低检出量为5pg；使用方便，适合于批量检测。应用该探针对从山东、江苏、四川等地采集的196只鸭病料，共1025份脏器的组织DNA进行检测，结果个体阳性率为33.2％，在各脏器中法氏囊、肝脏、脾脏的DuCV检出率较高，检出率分别为52.3％、49.2％、38.5％。
　　 通过PCR方法扩增完整的Cap基因，按正确的阅读框架将其克隆入pFastBac TMHTB 杆状病毒载体中，将筛选的阳性重组载体pF-CP，转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞中，经过蓝白斑筛选和PCR 鉴定，获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9 昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Westernblot和间接免疫荧光（IFA）试验结果表明，本研究成功构建了表达鸭圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒，表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性。
　　 DuCV FJ0601株Cap蛋白N端存在36个碱性氨基酸（AA），通过软件PROSITE分析发现此区域存在两个二分裂核定位信号（Bipartite nuclear localization signal），分别位于Cap蛋白N端的第2～17位AA和第21～36位AA。为进一步研究鸭圆环病毒Cap蛋白的生物学功能，我们构建了一系列Cap相关的融合表达质粒，对其核定位信号区进行了相关研究。首先将强型绿色荧光蛋白（EGFP）插入pFastBacTM HTB载体，构建pF-EGFP重组质粒，然后构建pF-EGFP-CP、pF-EGFP-CP-Δ17N（N端缺失2-17个AA）和pF-EGFP-CP-Δ36N（N端缺失2-36个AA)三个重组质粒分别转染Sf9 昆虫细胞。结果显示pF-EGFP-CP、pF-EGFP-CP-Δ17N蛋白定位在细胞核中，而pF-EGFP-CP-Δ36N蛋白定位在胞质中，这一结果证实了PROSITE软件预测的DuCV Cap中的核定位信号为功能性核定位信号。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符 号 说 明

声明

1前 言

2材料和方法

3 结果与分析

4 讨论

5结论

6参考文献

7致 谢

8攻读学位期间发表论文情况