mChIL-18基因与IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBacTMDual中的共表达及其免疫原性研究

摘要

白细胞介素18(Interleukine-18，IL-18)是一种多效细胞因子，具有强烈的IFN-γ诱生能力，对机体起着重要的免疫调节和保护作用，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力，因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达，从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗;由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现得比较晚，而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道，且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacTM Dual载体含有PH启动子和p10启动子，可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。His标签的引入为重组蛋白的纯化提供可能，为获得大量有生物活性的蛋白开辟了新途径。
　　 传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD病毒(IBDV)感染雏鸡引起的以淋巴组织，特别是中枢免疫器官-法氏囊为主要特征的高度接触性传染病。该病主要导致机体免疫抑制，使机体的免疫能力降低和疫苗免疫接种失败。虽然灭活疫苗和减毒活疫苗是相当成熟的，但由于IBDV强毒株和抗原变异的出现使其免疫效价降低。VP2是IBDV的主要保护性抗原，已经鉴定的IBDV中和表位主要在VP2上，并且多为构象依赖性，这意味着VP2的立体结构对其中和表位的形成至关重要，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。
　　 禽流感(Avian influenza，AI)是由AI病毒(AIV)感染引起的一种高度接触性人畜共患传染病。HPAI的暴发给养禽业带来了一定的经济损失，H5N1亚型AI的出现不仅产生经济损失，还带来了恐慌。AIV的主要抗原决定簇都位于HA1区域。体外表达HA1涵盖了所有的HA空间中和表位，故其完全可以替代HA作为抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。
　　 本试验分别以pMD18-T-VP2，pMD18-T-HA1和 pMD18-T-mChIL18质粒为模板，以杆状病毒pFastBacTM Dual为载体，将mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别插入到载体的PH启动子和P10启动子的下游，构建重组转移载体质粒pF-IL18，pF-VP2,pF-IL18-VP2，pF-HA1，pF-IL18-HA1。将其转化DH10Bac感受态细胞，经三重抗性(含卡那霉素、庆大霉素和四环素)与蓝白斑筛选，用小量法提取重组杆状病毒质粒rBac-IL18，rBac-VP2，rBac-IL18-VP2，rBac-HA1，rBac-IL18-HA1，通过一对通用引物M13 (Bacmid含有该引物Forward和 Reverse两个引物位点，能够从两侧扩增LacZa互补区域内的mini-attTn7位点，有利于PCR分析)进行PCR扩增鉴定。在转染试剂CellfectinⅡ的作用下，通过脂质体介导法将纯化的rBac-IL18， rBac-VP2， rBac-IL18-VP2，rBac-HA1，rBac-IL18-HA1转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9，sf9)获得P1代重组杆状病毒，用P1代病毒感染sf9来扩增病毒滴度，将达到一定滴度(107～108pfu/mL)的P3代重组杆状病毒感染sf9，感染72h后收获sf9细胞及培养上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测和间接免疫荧光试验(IFA)检测。SDS-PAGE检测显示，mChIL-18，VP2，HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表达，即表达的蛋白是可溶性的，表达的目的条带分子量分别约为19.5 KD,48.4 KD,37.4 KD。IFA检测显示mChILl 8基因与VP2基因或HA1基因分别同时在同一细胞中独立表达。
　　 采用鸡脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)、IFN-γ诱导实验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验对表达的蛋白进行生物学活性测定。鸡脾淋巴细胞增殖试验表明，不同浓度的pIL18，pVP2-IL18和pHA1-IL18均能够明显促进淋巴细胞的增殖，随着蛋白浓度的增加刺激转化作用逐渐增强，均当浓度为200ng/mL时，刺激转化效果最佳，增殖指数可达4.13,4.35,4.09，但随着蛋白浓度的增大淋巴细胞的增殖指数逐渐降低。VSV病毒活性抑制试验表明，当蛋白浓度大于100ng/mL时能刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ，并且‘随着pIL18，pVP2-IL18和pHA1-IL18浓度的增加诱导产生IFN-γ的量随之增加;将不l司稀释度的IFN-γ分别作用于VSV，在IFN-γ≥1 X102U/mL时，具有较强的抑制效果，当IFN-γ为10 U/mL时，只能达到约50％的保护。该结果说明pIL18，pVP2-IL18和pHA1-IL18的抗病毒活性是通过IFN-γ实现的，且在一定浓度范围内具有抑制VSV病毒产生细胞病变的作用。 将含有pIL18，pVP2，pVP2-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物，14d时一免,28d时二免Ⅰ组为传统疫苗组;Ⅱ组为pIL18与B78减毒疫苗联合疫苗组;Ⅲ为pIL18与pVP2联合疫苗组;Ⅳ组为pVP2-IL18单独免疫组;Ⅴ组一免注射B78减毒疫苗，二免注射pVP2-IL18；Ⅵ组为pVP2单独免疫组;Ⅶ组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测，从统计学意义上分析处理数据。结果表明，与免疫前和阴性对照组相比，各试验组都促进CD4+和CD8+T细胞增殖。一免后各试验组CD4+T细胞都呈上升趋势，但一免后7d后又呈下降趋势;二免后Ⅰ，Ⅲ,Ⅴ呈上升趋势且持续时间比较长，其中Ⅳ组CD4+T增殖水平最高，在一免后21d,28d,35d都与其它组差异显著(P<0.05)。一免后各试验组CD8+T细胞都呈上升趋势，但一免后7d后又呈下降趋势;二免后各实验组仍呈不同下降趋势，其中Ⅰ组CD8+T增殖水平最高，在一免后14d,21d,28d都与其它组差异显著((P<0.05)。体液免疫水平通过使用传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒检测，从统计学意义上分析处理数据。结果表明，与免疫前相比，各试验组都有较好的促进IBD抗体生成作用，抗体水平都持续增高且维持时间也较长，都在在一免后28d抗体水平达到最高;与阴性对照组相比，Ⅳ组效果最好，抗体效价最高，Ⅴ组次之，然后是Ⅱ组、Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅵ组。攻毒试验结果表明，Ⅵ组保护率可达90％，Ⅴ组次之可达80％，然后是Ⅰ组和Ⅱ组75％，Ⅲ组为70％，Ⅵ组50％，Ⅶ组无一幸免。
　　 将含有pIL18，pHA1，pHA1-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物,7d时一免,21d时二免。Ⅰ组为传统疫苗组;Ⅱ组为pIL18与传统疫苗联合疫苗组;Ⅲ为pHA1单独免疫组;Ⅳ组为pHA1-IL18单独免疫组;Ⅴ组pIL18与pHA1联合疫苗组;Ⅵ组为pHA1单独免疫组;Ⅶ组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测。结果表明，与免疫前和阴性对照组相比，各试验组都能够明显促进CD4+和CD8+T细胞的增殖反应。一免后各试验组CD4+和CD8+T细胞都呈上升趋势，但一免后7d后又呈下降趋势;二免后虽呈上升趋势且持续时间比较长，但增殖幅度不大，以IV组CD4+T增殖水平最高。体液免疫水平通过使用血凝抑制试验检测。结果表明，各试验组都有较好的促进ND，H5型AI和H9型AI抗体生成作用，都是在一免后28d抗体水平达到最高;与阴性对照组相比，Ⅳ组效果最好，抗体效价最高与其它组差异显著((P<0.05)。

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文摘

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论文说明:符号说明

声明

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨 论

5 结 论

6 要键文词

7 附录 免疫器官的剖检对比

8 ：增

9 攻读学位期间发表论文情况