荒漠地区优势地衣石果衣Endocarponpusillum Hedwing全长cDNA文库的构建与初步分析

摘要

地衣作为一种特殊的菌藻共生复合生物或共生联合体，也被视为有控制地寄生于藻类或蓝细菌上的真菌，即地衣型真菌，它能适应低温、干旱等恶劣的生存环境。从严寒的南北两极到酷热的赤道，从高山到平原，从潮湿的土壤到干旱的沙漠，在其它植物不能生长的地方，常常可以找到地衣。本研究面向干旱沙漠治理的国家需求，围绕干旱沙漠生物地毯工程的基础研究，从地衣中筛选抗旱基因以创造抗旱转基因植物提供基因资源和技术储备，以沙坡头地区地衣优势种石果衣（Endocarpon pusillum Hedwing）中分离的共生菌为材料，从中进行抗旱基因筛选及其功能分析，主要进行了以下的研究：
　　 （1）率先构建了国内外第一个地衣型真菌的全长cDNA文库，其文库的滴度为1.5×106cfu/mL，重组率为95.5％。根据文库小规模测序结果，筛选出111个全长基因序列。这些序列在地衣型真菌中为国内外首次报道，BLAST结果显示42个CDS序列与非地衣型真菌有关基因的同源性大于75％；30个CDS序列与非地衣型真菌基因的同源性为60％-74％；28个CDS序列与非地衣型真菌基因的同源性小于60％，而11个CDS序列未发现与非地衣型真菌有同源性。由此可以推测，这些基因可能为地衣型真菌所特有，与地衣型真菌与藻类共生相关，或者在干旱荒漠地衣生命活动中起重要作用。
　　 （2）利用绝对定量PCR方法计算石果衣共生菌基因组的大小。从文库中挑选15个基因进行测定，选择其中10个扩增效率接近理论值的基因结果作为计算数据，最后得出共生菌的基因组大小的平均值为39.13Mb。
　　 （3）利用相对定量PCR方法计算rRNA基因重复单位的数目。选择3个基因（SCD，ATA，RPB11a）作为相对定量的参照基因。通过BLAST比对得知这三个基因在非地衣型真菌中为单拷贝基因。最后，计算出重复单位数目的平均值为43。
　　 （4）构建含有原肌球蛋白（Tropomyosin-1）编码全长cDNA的重组载体，然后转化入E.Coli BL21中，经IPTG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化。这将有利于以后对地衣型真菌蛋白的研究。
　　 全长文库的构建有利于地衣型真菌抗性基因和新基因筛选工作的开展。基因组大小和rRNA基因的重复单位的测定，为全基因组测序工作奠定了基础。本研究填补了地衣分子生物学知识的空白。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

声明

1绪论

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文