CcRPⅡ基因转化圆红大枣抗枣疯病研究

摘要

我国是枣树的起源地和栽培中心，种质资源非常丰富，枣树是我国第七大果树和第一大干果树，枣果尤其是鲜食果的营养和药用价值很高，被喻为“二十一世纪的生态经济树种”。枣疯病是枣树生产上的一种具有毁灭性的侵染性病害，几乎分布于国内外所有的枣树栽培区。目前还没有较好治疗枣疯病的办法，其中筛选和培育抗枣疯病品种或品系是解决枣疯病的重要途径之一，作为利用传统的杂交育种方法很难较快地得到抗病品种，近十几年来，国内外迅速发展的转基因技术已经在果树育种中得到了广泛的应用，并且已经取得了长足发展，转基因技术已经成为果树品种改良最有前途的技术方法之一。农杆菌介导法在农作物上取得了令人鼓舞的成绩，但是在果树上应用的研究却极少，由于果树育种周期长，不断地摸索试验快速有效的育种方法是很有意义的。本研究对圆红大枣进行了抗病基因转化试验研究，并成功将香樟RIPCcRIPⅡ基因通过农杆菌介导成功转化入圆红大枣中，并对组培苗进行生理指标测定，其主要研究内容如下：
　　 1.再生体系的建立。BA对愈伤组织颜色、新生侧芽个数影响最大，NAA对新侧芽生长、愈伤组织大小影响最大；KT对新生侧芽个数、新侧芽伸长生影响力一般，对愈伤组织大小影响最小；MS+BA1.0mg/L+KT1.5mg/L+NAA0.01mg/L培养基配方最利于新生侧芽增殖；MS+BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0.01mg/L培养基配方有利于愈伤组织增大；MS+BA3.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0.05mg/L培养基配方最利于侧芽伸长生长。
　　 2.农杆菌介导CcRIPⅡ基因转化体系的优化。选取部位为茎段，DNA菌液原液或1/2原液浓度，浸染10min或20min，培养平均分化数值最大，为2.4个芽和1.7个芽；选取部位为茎尖，DNA菌液为1/2原液或原液浓度，浸染15min-20min，平均苗高较高分别为1.31cm和1.15cm；全绿苗率也较高，分别达62.5％和75.5％。
　　 3.采用L9(34)正交优化试验设立农杆菌浸染部位、浸染时间以及DNA浓度三个影响转化效果的重要因子进行了分析比较，结果表明，采用1/3原液浓度的菌液浸染茎尖20min，转化效果最佳。
　　 4.对获得的圆红大枣转基因苗，进行PCR分子验证，有10株检测阳性，表明外源CcRIPⅡ基因已整合到圆红大枣基因组内。
　　 5.转基因植株抗病能力分子鉴定结果表明，转基因植株未发现枣疯病植原体标记产物的阳性表达，未转基因植株有3株出现丛枝病阳性表达，病毒感染率达到15.0％，说明转基因植株较未转基因植株对丛枝病支原体表现出较高的抗性。
　　 6.通过对转基因株系与未转基因株系组培苗抗病性生理对比，SOD、POD、CAT酶活性均有所增强，其中SOD、CAT酶活性显著增强：游离脯氨酸和可溶性蛋白的含量也呈上升趋势。