ZmBT1、ZmAATP基因的克隆及转ShYS、BRi基因玉米植株的获得与鉴定

摘要

玉米作为当今世界重要的粮食作物，其籽粒中淀粉含量高达70％～80％，提高玉米胚乳中淀粉含量有利于增加玉米产量。转基因技术是改良玉米遗传性状，提高玉米产量的重要手段。
　　 在禾本科作物中，淀粉合成的前体ADP－葡萄糖(ADP-Glc)在细胞质中生成，经跨膜转运到淀粉体内参与淀粉合成。通过增强ADP-Glc进入质体的转运能力，可以有效的提高淀粉合成效率。本研究克隆得到玉米ADP-葡萄糖转运蛋白基因ZmBT1和玉米ATP-ADP转运蛋白基因ZmAATP。ZmBT1蛋白属于腺苷酸转运载体系统，在玉米植株内组成型表达。ZmAATP蛋白与ATPase亲缘关系较近，该基因的表达随着玉米籽粒的发育和物质积累而逐渐升高。我们分别构建了由组成型启动子(Ubi)和胚乳特异型启动子(GluAI)驱动的ZmBT1基因和ZmAATP基因的过量表达载体，为进一步研究该基因在玉米中的生物学功能，进一步进行玉米遗传改良奠定了基础。
　　 本研究通过农杆菌介导的玉米幼胚转化体系，将修饰后的淀粉合成ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(ShYS)及淀粉分支酶基因的RNAi表达盒(BRi)成功的转入玉米Q319自交系中。实验共侵染外植体14661个，获得T0代607株成活的转基因植株，最终得到170个结实的T0代转基因株系。从T0代种子中，选择103个株系进行T1代种植，并对T1代进行考种。PCR检测获得10个稳定表达的转基因株系，其中，ubi：BRi基因型7株，ubi：ShYS基因型3株。选取这10个株系的种子，在T2代分别在基因组水平，蛋白水平和基因表达水平进行检测。实时荧光定量PCR结果显示，在阳性植株内ShYS基因的表达量明显升高，SBEI，SBEⅡb基因的表达量部分受到抑制。酶联免疫反应ELISA结果显示，转基因植株中均可以检测到抗性基因NPTⅡ抗性蛋白的表达。综合分子检测结果表明，初步确定成功获得了Ubi：ShYS过量表达的转基因植株和Ubi：BRiRNA干扰的转基因植株。