同时鉴定转甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的方法

摘要

本发明涉及转基因植物检测领域，具体涉及同时鉴定转甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的方法。本发明中设计的针对转入的半乳糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶的外源基因的引物可以同时鉴定转基因玉米饲料中的该四种外源基因，这为今后饲用酶转基因玉米原料成分的快速鉴定检测提供了方法。

说明书

技术领域

本发明涉及转基因植物检测领域，具体涉及同时鉴定转甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的方法。 

背景技术

除常规的抗虫抗病转基因品系外，随着基因工程技术的发展，针对饲用的功能性转基因作物新品种培育已成为研究热点，如已经获得安全认证的转植酸酶基因玉米在绿色饲料生产中具有良好的应用前景。转甘露聚糖酶基因、转葡聚糖酶基因、转木聚糖酶基因和转半乳糖苷酶基因玉米是针对减少饲料中抗营养因子，提高饲喂动物营养性能开发的新型饲用功能性转基因玉米品种，由于目标酶能够在玉米籽粒中特异表达，因此作为原料进行饲料生产时可以减少微生物发酵来源酶制剂的添加过程，从而大量节约酶制剂的使用成本。 

转基因生物及其产物使用的前提是保证其安全性，目前国内转基因作物大量用于饲料生产，这些饲料饲喂的畜禽及产品的食物链终端是人，所以转基因作物成分检测是整个转基因安全性评价体系中重要一环。PCR技术作为常规经典的分子生物学技术可以在分子水平上快速有效的检测极少量样品的目标成分。 

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。尽管多重PCR拥有较多的优点，它也有许多不容忽视的缺点，包括多对引物之间的相互作用、低扩增效率，以及不同的模板对引物的影响。这些缺点抑制了多重PCR的应用。研究表明，对于成功进行多重PCR尤为重要的因素是：用于扩增不同基因的不同引物对设计、引物对之间的相对浓度、PCR缓冲液的浓度、延伸温度、延伸时间、退火时间、退火温度、PCR循环数、氯化镁和dNTP浓度间的平衡等等。其中最重要的设计合理的引物，使其在多重PCR反应中，可以高效地扩增目的基因片段。 

随着转基因作物的快速发展，越来越多的研究已经利用多重PCR的方法快速、简捷地进行转基因作物的筛选。目前，已开发了利用多重PCR方法检测转基因大豆及玉米的方法（Forte,V.T.,et al.,Food Control,l6,535-539,2005;Germini,A.,et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry,52,3275–3280,2004）。转基因植物作为饲料，利用多重PCR反应可以进行饲料中多种基因同步鉴定，同时从饲料中扩增出目的条带，通过减少反应次数，节省了时间、人力、和物力（Mafra,I.,et al.,European Food Research and Technology,227,649–665,2008）。 

本发明以甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因序列设计特异引物并优化PCR体系及条件，能从混合基因组模板中有效扩增目的基因片段，为今后饲用酶转基因玉米原料成分的鉴定检测提供方法。 

发明内容

本发明的发明人为了克服上述问题提出并完成了本发明。 

因此，本发明的目的是提供同时鉴定转甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的方法。 

本发明的再一目的是提供同时鉴定转甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的试剂盒。 

本发明的另一目的是提供能够同时鉴定转甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的引物组合。 

根据本发明的同时鉴定转甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的方法包括使用以下引物进行PCR扩增的步骤： 

引物名称 引物序列(5′→3′) 长度(bp) A-F TCAATCTTAAGAGAGTTTCG 20 A-R GTCTCGAAGACATGGTACAG 20 G-F GACTCCGTGACCCTGCGCCAGT 22 G-R CCAGATGCTGAAGATCAGGACCATGCC 27 M-F GTCAAGATCGTCCTGAACTT 20 M-R AGCTTGGTGTCCTTCAACAC 27 X-F GGACCTACACGTGCTCATGGGACG 24 X-R GCCTCGACCGCCATAACCTGGAAG 24

根据本发明的同时鉴定转甘露聚糖酶基因、葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因和半乳糖苷酶基因植物的试剂盒包括上述引物组合。 

根据本发明的方法，其中所述半乳糖苷酶基因为α-半乳糖苷酶基因agaF75m，是从Gibberellasp.F75中获得的aga-F75（GenBank FJ392036）经密码子优化而得，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示： 

ggatccgcggagtccagcgacccaatccacgtcgatggcacctccttcgccctcaacggcgacaatgtcagctacaggttccacgttgataataccactggcgaccttatcaacgatcattacggaggaccagtggctgaggacggaattactgctgagatcggccctattcagggctgggtgaacctcatcggaagggtcaggcgcgagttcccagaccacggaagaggagatttccggattccggcgttccaactgcagcaagcctcgggcacaacggtcaccgacttcaggtacaagtcccatgaggtggtcgagggaaagccaggactgccaggactcccttctactttcggcgaggccgacgatgtttcaacactggttgtgcgcatgtacgacaactactcttcaatcgcggtggatctctcttactcaattttccccaagtacgacgccgtcgttaggtctgtgaacatcacgaatcgcggcaacgctaccgtcaatcttaagagagtttcgtcctggtccgtggatctgcagcaagacaaccttgatctgatcgagattagaggagactgggctagggagggaatgagagttagacggaaggtggatttcggcactcagggcttccaaagctctacaggctactcatcgcacctccataacccgttcctcgctcttgtggcgagcaccactacagagacgcagggagaggcttggggattctcgctggtctacaccggctccttcgctgtcgacgttgagaagtccagccaaggcctcactagggccatccttggcgtcaattctctggatttctcatggcccctcaagccgggccagacattcacgacccccgaggtggtctcagttttctcgaacaagggcgtgggcggcatgtctaggcaattccacaggctctaccgcaagcatcttatgaagtctaagtacgctgaggagacgcgcccggtgctgctcaattcatgggagggcctcggcttcgagatcaacgagaccgcgatcgagaagattgccaagcagtccgctgaccttggcattaagctgttcgtgatggacgatggctggttcggcaataagtacccgagggtcaacgacagcgctggcctgggcgattggcagccgaataaggagaggttcccagacggccttacgcctctggttgagaatatcaccgagctgcgcattgccaacgcttccgacgatctcaagttcggcatctggttcgagcccgagatggtgaacccgaagtcggacctgtacgataagcacccagactgggccattcatgctggcagctaccctagaactgagacacggaatcagctggtgctcaacgtcgcccttccagaggttcaagagttcatcattgattcggtgtccaagatcctgcgggagtcccctattagctacgtgaagtgggacaacaataggggcatccacgagacgcctgatcccaccctcaactacaagtacatgcttggcctgtaccatgtcttcgagacgctcaccagccgcttcccagacgttctttgggagggatgcgcttctggaggaggaagattcgatccaggcgtcctgcagtggttccctcaaatctggactagcgacgatacagacgcggttgagaggatcgccattcagttcggcaccagcctcgcttacccgccatctgcgatgggcgcccacctttcacatgtccctaacggcaatacgcaaagaattacctcggtcaagttccgggctcacgttgcgatgatgggcggctcattcggcgttgagctggacccatcggatctcgagcctgaggagagagagcagatccccggcctcattgagctttctgagaagatcaatccgatcgtgattactggcgacttctaccgcctcgctcttcccgaggagacaaactacccggcgggccagttcatctccgaggatggcaagaaggttgtgctcttcgctttccaaactagggcgacaattaacaattcctggccttggttcagactgcagggactcgacgctagcgccaagtacagagtggataacaatcagactgtcagcggctctacacttatgaacatgggcatccaactgaccttcgagggcgactacgattcccatgtgctgatgattgagaagcagtgacctagg 

根据本发明的方法，葡聚糖酶基因bgl7Am为从Bispora sp.MEY-1中获得的bgl7A经密码子优化而来（GenBank FJ695140），其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示： 

cagcagatcggccgcatcccggaggtccaccccaggctcaccacccagacgtgcaccaagcacggctgcacgacccagcagacctccctggtcctcgacgccctgtcgcacccgatcgacgacatccataccaacgagtcctgcgagacgtccagcggcggggtgaacaccacgatctgccccacggtggaggtctgcgccgagaactgcgcgctcgagggcgtcaactacgcctcccacggcgtgtacacgaacggcgactccgtgaccctgcgccagtacctcaacatcgacgggaccgaggaggaggtgtcgccgcgcgtctacct gctcgaccccagcggcagggactacgagatcctgaagctgctcaaccaggagatcagcttcacggtcgacgtctccaacctgccgtgcggcatgaacggcgctctgtacctcacgtccatggacgcctcgggcggccgcagccagctcaacccggccggggcgacctacggcaccggctactgcgacgcgcaatgcaacgcccccgcctggatcaacggcgtggccaacctgaagggccttggggcatgctgcagcgagatggacctctgggaggccaactcggaggcgacccagctcaccccccacgcctgcaacgtcacgggcttctacgagtgctccggggcggcctgcggcagcaacggcgtgtgcgacaaggacggctgcggcttcaacccgtacggcctgggcgaccactccttctacggcccgagcgtcaccgacacgatcgacacgaagaagcccttcaccgtcgtcacccagttcctgacctcggacggcacgtccacgggcaccctcagccagatccgccggctgtacctccagaacggcaaggtcatccagaacgcgaaggtcgacttcgacaactcgacgctggacagcatcaccccggcctactgcgaggccacggcggccaccttcgaggccgagggcgggttcccccagatgggcaaggccctcgagatgggcatggtcctgatcttcagcatctggaacgaccccagcgccttcatgaactggctggacagcggcacggcgggaccgtgcaacagcacccagggcaacccggcgctcatcgaggccgagaaccccggcaccagcgtgaccttctccaacatcaagtggggcgacatcggcacgacctactccggctcgggctccggcgggtggaac 

根据本发明的方法，其中，甘露聚糖酶基因man5As是从Bispora sp.MEY-1中获得的man5A（EU919724）经N端截短及密码子优化而得，其核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示： 

ccggcgtaccccatctgcacctcgcgcgcgccgttcgcgagcatcgacgacgtgcacccccggctcttcaactacaacggcaccggcgccaagtacttcgccggcaccaacgcctggtggacgagctacctgatgatcgactccgacgtgaacctcgtgttctccgagatcaagaacacccagctgcaggtggtcaggatctgggggttcggcagcgtcaacacggaccccgggccggggacggtcttcttccagctcctgaactcgaccggcagctacatcaactacgcggcgaacggcatcccccgcctcgacgcggtggtctcctacgccgagaggaacggcgtcaagatcgtcctgaacttcgtgaacaactggagcgccctcggcgggatcgcctcctacaacgccgccttcggcgggaacgcgacctcctggtacaccgacgccgagagccagaaggtgtacaaggactacatcaagctgctggtgaaccggtacaagtgctcccccgccatcttcgcgtgggagctggcgaacgagccgcgctgccaggggtgcgacaccagcgtgatctacaactgggccacggaggtctcccagtacatcaagagcctcgacccccggcacatggtggccctcggggacgaaggctggttcgcccccgccgacggcatcggcgacgggtcgtacgcgtacagcggcgaccagggcgtcgacttcgtcaagaacctaggcatcaagaccctggactacgggaccttccacctctacccgtcctcctggggctacaacgagtcctggggctcgacgtggatcctgcagcacaacgaggtgggggccgcccacaacaaggcggtcgtcctcgaggagtacggcggcccgcccacgccgaacaaccacacggcggtcgaggagccctggcaggcgacggtgttgaaggacaccaagctggccatggaccagttctggcagttcggcaccgtcctgagcaccggcctctccgactacgacaacttcacgatctggtacaactcccaggagtacgtccccctggcgcgcgaccacgccgcggccatgctggagaagccggtg 

根据本发明的方法，木聚糖酶基因xyl11As是从Bispora sp.MEY-1中获得的xyl11A经密码子优化而来（GenBank HM003044.1），其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示： 

ggatccatcccgactattgagaagcgcaacccagggggcattaactacgtccagaactacaacggcgatgtggctgatttccagt acaacgagggcgctgggacctacacgtgctcatgggacggctccactgatttcgtggtcggcctcgggtggtctacgggcgctgcgcgggacatcacgtactcggctacatacaacgccggcgggtccggcagctacctggctgtctacgggtgggttaattccccgcaggctgagtactacattgttgagagctacggcgactacaacccatgcagcgatgctgagtcgctcggcaccctggagtcggacgggtctacatacactgtgtgcaccgatacgcgcacaaatgagccgagcatcactggcacctcgacgttcacacagtactggtctgtccgccagtcagagaggacctccggcactgttaccgtggggaaccacttcaattactgggcgcagcatggcttcggggattcctacaacttccaggttatggcggtcgaggcgttcagcggcagcggctcagcgtccgtgtcggtgtcccccggg 

为了从混合基因组模板中有效扩增目的基因片段，本发明设计了针对的半乳糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶的转基因玉米中外源基因的引物对。既要确保引物之间的相互作用较小，且对多重PCR扩增体系及扩增条件进行了摸索，得到一个较好的扩增体系及扩增条件。本发明还从各引物特异性检测、模板混合物对引物的特异性影响及引物混合物中引物的特异性进行检测。检测结果表明，设计的四对引物的特异性较好，且在多重模板及多重引物对其特异性没有较大影响。另外，在四种转基因玉米基因组模板及四对引物同时存在的混合物中，检测了本发明中引物的扩增效率。结果显示该四对引物在多重PCR反应中的扩增效率较好。 

由此可以看出，本发明中设计的针对转入的半乳糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶的外源基因的引物可以同时鉴定转基因玉米饲料中的该四种外源基因，这为今后饲用酶转基因玉米原料成分的快速鉴定检测提供了方法。 

附图说明

图1四种饲用酶转基因玉米基因组凝胶检测。 

图2四种饲用酶基因引物特异性检测。A：aga，G：glu，M：man，X：xyl；1：半乳糖苷酶转基因玉米基因组为模板，2：葡聚糖酶转基因玉米基因组为模板，3：甘露聚糖酶转基因玉米基因组为模板，4：木聚糖酶转基因玉米基因组为模板，5：非转基因玉米郑58基因组为模板，6：无菌水为模板。 

图3四种转基因玉米基因组混合物为模板对引物特异性的影响。 

图4四对引物混合物对各引物特异性的影响。 

图5多重PCR体系检测效率。 

具体实施方式

1、实验材料：四种转饲用酶的玉米，分别为α-半乳糖苷酶，葡聚糖酶，甘露聚糖酶，木聚糖酶。其中α-半乳糖苷酶基因agaF75m是从Gibberella sp.F75中获得的 aga-F75（GenBank FJ392036）经密码子优化而得，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；葡聚糖酶基因bgl7Am为从Bispora sp.MEY-1中获得的bgl7A经密码子优化而来（GenBank FJ695140），其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；甘露聚糖酶基因man5As是从Bispora sp.MEY-1中获得的man5A（EU919724）经N端截短及密码子优化而得，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；木聚糖酶基因xyl11As是从Bispora sp.MEY-1中获得的xyl11A经密码子优化而来（GenBank HM003044.1），其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。 

2、化学试剂：CTAB及RNaseA来自于Ameresco公司，氯仿及无水乙醇来自于北京化工厂，异戊醇和异丙醇来自于汕头市西陇化工厂有限公司，Tris-饱和酚则由北京金博卓越生物科技有限公司提供；Taq聚合酶来自于Genstar公司。 

3、实验设备：离心机购自于Sigma公司，PCR仪购自于Eppendorf公司。 

4、本发明中所涉及到的引物及其序列见表1： 

表1 

引物名称 引物序列(5′→3′) 长度(bp) A-F TCAATCTTAAGAGAGTTTCG 20 A-R GTCTCGAAGACATGGTACAG 20 G-F GACTCCGTGACCCTGCGCCAGT 22 G-R CCAGATGCTGAAGATCAGGACCATGCC 27 M-F GTCAAGATCGTCCTGAACTT 20 M-R AGCTTGGTGTCCTTCAACAC 27 X-F GGACCTACACGTGCTCATGGGACG 24 X-R GCCTCGACCGCCATAACCTGGAAG 24

实施例1四种饲用酶转基因玉米基因组提取 

1、四种转基因玉米获得的方法 

将密码子优化得到的目的基因连接到植物表达载体pHP20754上，利用基因枪的方法转入玉米愈伤组织中。利用选择培养基筛选阳性的愈伤组织，将筛选到的愈伤组织再生得到T0代载体，后与非转化的玉米系郑58进行杂交即获得转化后的玉米。植物表达载体pHP20754、愈伤组织及郑58玉米均来源于中国农业科学院生物所陈茹梅研究员。 

2、玉米基因组的提取 

1）CTAB配制 

成分 最终浓度 CTAB 2% NaCl 1.4mol/L

[0041] 

EDTA-Na2(pH8.0) 20mmo l/L Tris-HCl(pH8.0) 100mmol/L β-巯基乙醇 0.2%

2）取50-100mg新鲜玉米叶片，液氮研磨。加入0.6ml预热的CTAB，充分混合，65°C裂解1h，期间每10min轻柔颠倒混合一次。 

3）加入等体积氯仿：异戊醇，轻柔混匀2min，12,000rpm离心5min，吸取上清液置于新的1.5ml Eppendorf管中。 

4）加入等体积异丙醇，轻柔颠倒混匀，于室温中静置5min，然后12,000rpm离心5min,弃上清。 

5）加入0.5ml的70%乙醇，轻柔旋转，清洗沉淀表面，8,000rpm离心5min，弃上清。 

6）沉淀干燥后（自然风干、烘箱烘干），加入50μl的蒸馏水溶解沉淀。 

7）每管加入5ul RNaseA，37°C处理1h。 

8）取5ul于0.8%凝胶检测DNA质量。结果见图5 

实验结果表明基因组提取质量较好，可以进行下一步实验 

实施例2四种饲用酶基因的引物特异性检测 

利用半乳糖苷酶aga引物A-F/R、葡聚糖酶glu引物G-F/R、甘露聚糖酶man引物M-F/R、木聚糖酶xyl引物X-F/R，分别以aga、glu、man及xyl转基因玉米基因组为模板，检测四对引物的特异性。以非转基因郑58玉米基因组及ddH2O为模板，做阴性对照。 

引物浓度：20μmol/L；基因组定量：1μg/μl 

反应体系： 

PCR反应参数：95°C5min，95°C30sec，60°C30sec，72°C60sec，30个循环，72°C10min。 

实验结果如图1所示，以引物A-F/R进行实验时，仅以半乳糖苷酶转基因玉米为模板时会有1028bp特异条带；以引物G-F/R进行实验时，仅以葡聚糖酶转基因玉米为模板时会有783bp特异条带；以引物M-F/R进行实验时，仅以甘露聚糖酶 转基因玉米为模板时会有607bp特异条带；以引物X-F/R进行实验时，仅以木聚糖酶转基因玉米为模板时会有433bp特异条带。该实验结果表明，本发明中设计的针对于agaF75m、bgl7Am、man5As及xyl11As的引物A-F/R、G-F/R、M-F/R和X-F/R特异性较好。 

实施例3多重基因组模板对各特定引物的特异性影响 

以四种饲用酶转基因玉米基因组为模板，分别利用四对引物半乳糖苷酶aga引物A-F/R、葡聚糖酶glu引物G-F/R、甘露聚糖酶man引物M-F/R、木聚糖酶xyl引物X-F/R进行PCR扩增，用以检测模板混合物对四对引物的特异性的影响。 

引物浓度：20μmol/L； 

基因组定量：1μg/μl 

反应体系： 

PCR反应参数：95°C5min，95°C30sec，60°C30sec，72°C60sec，30个循环，72°C10min。 

实验结果如图2所示，以四种饲用酶半乳糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶转基因玉米基因组为模板，分别利用引物A-F/R、G-F/R、M-F/R和X-F/R进行扩增时，能且只能扩增出对应的单一的特异条带，大小分别为1028bp、783bp、607bp及433bp。该实验结果表明，本发明中，混合模板对各引物的特异性没有影响。 

实施例4多重引物中的引物特异性检测 

分别以半乳糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶转基因玉米基因组为模板，利用四对引物，即A-F/R、G-F/R、M-F/R和X-F/R的混合物进行扩增，检测混合引物中的各引物的特异性。 

引物浓度：20μmol/L；基因组定量：1μg/μl 

反应体系： 

PCR反应参数：95°C5min，95°C30sec，60°C30sec，72°C60sec，30个循环，72°C10min。 

实验结果如图3所示，利用四对引物，即A-F/R、G-F/R、M-F/R和X-F/R的混合物对四种饲用酶转基因玉米基因组进行扩增时，分别以半乳糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶转基因玉米基因组为模板，能且只能扩增出单一的特异条带，大小分别为1028bp、783bp、607bp及433bp。该结果表明，本发明中，混合引物对引物自身的特异性没有影响。 

实施例5多重PCR体系的可行性检测 

以四种饲用酶转基因玉米基因组的混合物为模板，同时加入四对引物A-F/R、G-F/R、M-F/R和X-F/R进行扩增，以检测此四对引物在多重PCR反应中的效率及该多重PCR体系的可行性。 

引物浓度：20μmol/L； 

基因组定量：1μg/μl 

反应体系： 

PCR反应参数：95°C5min，95°C30sec，60°C30sec，72°C60sec，30个循环，72°C10min。 

实验结果如图5所示，以四种转基因玉米基因组混合物为模板，同时利用四对特异性引物进行多重PCR扩增时，可以同时扩增出特异的目的条带，大小分别为1028bp、783bp、607bp及433bp。该实验结果表明，本发明中设计的四对针对于半乳糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶转基因玉米的特异性引物A-F/R、G-F/R、M-F/R和X-F/R适用于多重PCR检测，且该多重PCR检测体系检测效率较好。