一株B亚型ALV的分离、前病毒全基因组序列分析和感染性克隆的构建

摘要

本文通过将孵化9-11d的种蛋制备鸡胚成纤维细胞培养，盲传3代(共9d)后，取ALV-p27抗原检测阳性的细胞上清液接种DF-1细胞系以排除内源性ALV干扰的方法，从山东某地方培育品系的鸡群中分离到一种外源性禽白血病病毒SDAU09E3。PCR扩增其env基因进行克隆测序，并与A、B、C、D、E、J亚群参考毒株进行了同源性分析，表明该分离株gp85的氨基酸序列与4株ALV-B参考株的同源性最高，均大于91％，而与其他亚型ALV参考株的同源性均低于87.9％，因此将此分离株划归为B亚群。根据GenBank中已发表不同亚群全基因组序列设计合成8对连续、相互部分重叠的引物，利用这些引物和分段克隆测序的方法，完成了该外源性禽白血病病毒分离株SDAU09E3的前病毒全基因组核苷酸序列测定(登录号为JF826241)，并分析了其结构基因和LTR与其他参考毒株的序列同源性和差异。同时还比较了从山东地方品系鸡群分离到的二株B亚型禽白血病病毒(ALV)SDAU09E3和SDAU09C2的全基因组序列及它们在细胞培养上的复制动态。这二株ALV-B的同源性为95.4％，与Genbank中3株B亚群参考株之间的同源性也均在91.0％～94.9％1间，而与其它亚群参考株的同源性均低于87.9％。与亚群无关的gag、pol基因和LTR的核苷酸序列比较表明，这二株ALV-B的gag和pol基因与所有比较的参考株的同源性均在93％以上。LTR与其他外源性ALV参考株的LTR间的同源性在72.6％～88.3％范围内，但与E亚群内源性ALV的LTR的同源性只有51.5％。然而，这二个ALV-B的LTR的同源性也只有74.8％，远低于其他基因组部分的同源性，特别是它们的LTR的U3区同源性只有68.8％，二者在二个CAAT分布上也显著不同。对这二株ALV-B在DF-1细胞上的复制动态比较表明，它们在细胞培养上清液中的TCID50值非常类似，但SDAU09E3株核衣壳蛋白p27抗原的含量显著高于SDAU09C2株。这表明，同一亚群的不同毒株在复制过程中，所表达的p27抗原量与所形成的具有传染性的病毒量间没有平行关系。这一差异与LTR-U3区的相关性则有待应用感染性克隆技术来做进一步深入研究。
　　 根据B亚型白血病病毒SDAU09E3前病毒基因组序列，设计覆盖全长的三对重叠引物，以提取感染SDAU09E3病毒的DF-1细胞DNA为模板，采用PCR方法分3段扩增出B亚型白血病病毒SDAU09E3株的前病毒cDNA，PCR产物经克隆后顺次连接入pUC19，获得一个含有完整ALV-B前病毒cDNA的重组质粒，命名为pUC19-SDAU09E3。重组质粒纯化后转染DF-1细胞，经抗ALV-A和ALV-B的小鼠血清对转染后的细胞作间接免疫荧光试验，收集转染后的p27检测阳性的细胞上清再感染DF-1细胞并传代检测细胞上清p27仍为阳性，证明获得了具有感染性的克隆化病毒rSDAU09E3，为进一步的研究奠定了基础。在构建的B亚型ALV感染性克隆的基础上，将病毒肿瘤基因-fps基因经适当修饰后插入SDAU09E3的前病毒基因组中的env和3’-UTR间，构建了重组质粒pSDAU09E3-fps，期望能拯救出类似RSV的携带病毒肿瘤基因、具有完整的病毒基因组且能具有急性转化能力的病毒，转染CEF后进行IFA可检测到env基因和fps基因的表达，但未能获得病毒和产生细胞转化现象。