IBDV致病性与VP5基因关系及GX8/99株细胞克隆化毒株免疫原性的研究

摘要

传染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)引起鸡的急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的中枢免疫器官一法氏囊，是危害世界养禽业的主要传染病之一。该病毒导致免疫抑制，造成对其他疫病的易感性增强和降低对其它疫苗的反应性。近年来，IBDV在分子水平对IBDV的免疫机理、致病机制、病毒分子的结构与功能方面取得很大的进展，但是仍有许多地方有待于进一步研究，特别是变异株、vvIBDV的出现，抗原的变异和多样性、血清亚型，使本病的防治和临床诊断困难，对养鸡业造成严重损失。
　　 IBDV为双RNA病毒科禽双RNA病毒属，利用当地分离的变异株或选用抗原性与当地变异株接近的疫苗株制成灭活苗或弱毒苗，以及利用多种毒株联合制成多价疫苗，可以使鸡群得到很好的免疫保护。我们在实施国家自然基金重大项目过程中，感染vvIBDVGX8/99株的鸡的发病率和死亡率比较高，鸡场出现免疫失败的现象频繁发生。本课题拟以vvIBDVGX8/99株为研究对象，将vvIBDVGX8/99株进行传代，研究从原始毒(鸡源毒)→鸡胚毒→细胞适应毒→细胞克隆化毒→克隆化毒株的细胞传代至30代的致病性，免疫原性的变化规律及其与核苷酸、氨基酸之间的关系。更好地掌握vvIBDV在整个传代致弱的过程中的免疫原性变化特点、vvIBDV“个体效应”的变化规律，同时进行不同免疫佐剂对四株克隆化毒株免疫效果影响的试验以探寻更好的佐剂和疫苗组合，为我国vvIBDV分子流行病学的研究及IBD的有效防治奠定基础。揭示超强毒的演变规律和毒力改变的分子基础，为解决超强毒毒力增强、超强毒能否致弱以及致弱过程中基因序列和核苷酸序列的变化，这种变化与病毒生物学特性的关系，弱毒株的生物学特性如何等急需解决的问题提供依据。
　　 1.超强毒IBDVGX8/99株不同传代毒致病性与VP5基因的关系分析
　　 本研究将vvIBDVGX-8/99株原代毒、鸡胚毒、克隆化毒、回传SPF鸡10代次毒及克隆化细胞传代20代次毒分别测定ELD50,以相同的ELD50病毒量分别接种SPF鸡，从而观察vvIBDVGX-8/99株在传代过程中致病性的变化规律。同时分别提取病毒RNA，通过RT-PCR、PCR扩增、基因克隆、核苷酸序列测定和分析，对IBDVGX8/99株的24株不同传代毒的VP5基因进行比较，发现其同源性在94％-100%之间。并且有15个易发生变异的位点，其中位点bp#2、#8、#52、#145、#232、#272、#310、#364、#385、#409的碱基变异引起了相应氨基酸的改变，而位点bp#18、#285、#331、#354、#397的碱基变异没有引起相应氨基酸的变化。通过比较分析，可以看到在致死率由原代毒的86.7％降为GXE10的43％时，VP5基因的核苷酸有四个位点发生了变异，致死率由GXE10的43％降为GXC23的3.3％H寸，VP5基因的核苷酸有10个位点发生了变异；而将GXC23克隆化后的4株毒株致病性变化不大，并且仅在GXC11-1的#8位点，GXCl2-1和GXCl4-1的#364位点发生变异；将4株克隆化毒株回传SPF鸡10代后的致死率有一定程度的回升，且有两个位点发生变异；4株克隆化毒株在细胞上连续传20代后其致死率都降为0,并且克降株5没有发生核苷酸变异，而克隆株1、2、4也仅有一个核苷酸位点发生变异。由此推论vvIBDV的致病性与VP5某些氨基酸的变异有一定的关系，更可能与病毒对细胞的亲嗜性关系密切，这为探明超强毒法氏囊病毒毒力改变的分子基础，从而解释自然界中vvIBDV出现的原因和致弱的原因提供了佐证。
　　 2.vvIBDVGX8/99克隆化毒株细胞致弱毒VP5基因原核表达系统的建立
　　 本研究以vvIBDVGX8/99株4株克隆化细胞毒GXCL1、GXCL2、GXCL4、GXCL5为研究对象，将4株已在CEF上连续传20代的克隆化细胞毒通过鸡胚成纤维细胞再传10代，对各克隆化毒每隔四代毒株的VP5基因进行测序。根据两部分的测序结果，从中选取3株氨基酸序列差异较大的毒株(GXC11-1、GXC12-10、GXC14-25)的VP5基因作为本部分的研究内容。应用RT-PCR技术从上述3毒株中扩增得到VP5基因，并将其克隆到原核表达载体pET32a中，构建了重组原核表达质粒pET32a-VP5，对重组表达质粒鉴定正确后，转化大肠埃希菌Rosetta进行诱导表达，SDS-PAGE和Westernblot检测结果表明，IBDV-VP5基因在大肠埃希菌Rosetta中得到了正确表达，所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。
　　 3.泰山松花粉多糖对4株IBDV克隆化毒株免疫增强效果的影响
　　 根据第二部分的研究选取4株氨基酸序列差异显著的克隆化毒株GXCL1-25、GXCL2-30、GXCL4-25、GXCL5-30,并采用泰山松花粉多糖为免疫佐剂(蜂胶佐剂作为对照)，对其免疫效果进行分析。将4株细胞毒测TCID50统一定量后，每一毒株分别设置无免疫佐剂(1、4、7、10)，松花粉多糖佐剂(2、5、8、11)，蜂胶佐剂(3、6、9、12)三个平行试验组，并设一组生理盐水空白对照组(13)。免疫SPF鸡，14日龄首免，25日龄进行二免。分别于一免疫后0、3、7d，二免后3、10、17、24d采血，用ELISA方法检测血清抗体效价和IL-2水平，全自动血细胞分析仪测定28与42日龄的外周血淋巴细胞比率，于28、42日龄每组剖杀5只测免疫器官指数，35日龄进行攻毒试验。对各试验组试验结果进行分析可发现二免后第10d左右抗体和IL-2水平均达到高峰，4株克隆化细胞毒免疫鸡造成了一定的法氏囊的损伤，而含免疫佐剂组避免了损伤的发生。攻毒试验表明各毒株免疫效果明显，但相互之间也存在一定的差异性。通过不同毒株与佐剂的免疫组合，全面分析其免疫效果，综合比较可得出以松花粉多糖为佐剂的GXCL4-25组免疫效果最好，为控制vvIBDV的感染提供一条新的途径。